论文部分内容阅读
[目 的]采用ApoE-/-缺陷小鼠高脂饲养构建动脉粥样硬化(AS)模型。通过脐带间充质干细胞(UCMSC)移植,探讨UCMSC对小鼠AS模型的治疗作用及其机制,为UCMSC治疗AS提供新的理论依据。[方 法]1、模型评价采用鼠尾鉴定方法鉴定ApoE-/-小鼠模型。自6周起高脂饲养ApoE-/-缺陷小鼠,采用主动脉弓movat五色套染法染色,血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)鉴定小鼠AS模型。2、UCMSC 鉴定采用组织贴壁法培养UCMSC,细胞培养传至P3代。镜下观察细胞形态,流式细胞术分析CD73、CD90、CD105、CD34和CD45阳性细胞比例,成脂、成骨和成软骨诱导实验检测UCMSC多向分化潜能。3、分组及治疗在UCMSC移植治疗实验中,实验将AS模型鼠随机分为治疗组(UCMSC移植治疗)、模型对照组(注射等量生理盐水),C57BL/6小鼠为正常对照组(注射等量生理盐水)。治疗组按1 ×107cells/kg经腹腔注射UCMSC,200μl/只,模型对照组和正常对照组经腹腔注射生理盐水,200μl/只。每周治疗一次,连续治疗8周,治疗结束4周后进行疗效评价。4、疗效评价治疗结束4周后,摘眼球取血法获得小鼠血清,治疗组、模型对照组和正常对照组组间比较小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C。颈椎脱臼法处死小鼠取材,比较治疗组、模型对照组和正常对照组小鼠心脏大小、心脏体重比的差异;油红O染色法和movat五色套染法染色小鼠主动脉弓并观察比较组间斑块形成差异;qPCR检测治疗组、模型对照组和正常对照组小鼠心脏和肝脏中自噬相关基因(Atg14、Atg7、Becn1、Lc3b、sirt1、sirt5)的差异。对治疗组、模型对照组和正常对照组小鼠血浆和肝脏中代谢组学进行分析,比较差异表达的代谢产物。[结 果]1、模型评价采用6周龄ApoE-/-小鼠与正常对照C57BL/6小鼠高脂饲养6周。收集鼠尾,对ApoE-/-小鼠与正常对照C57BL/6小鼠进行基因型鉴定,表明模型组小鼠确定为ApoE基因缺陷小鼠。高脂饲养三月后,取ApoE-/-小鼠与正常对照C57BL/6小鼠主动脉弓进行movat染色,ApoE-/-小鼠主动脉弓内壁有斑块形成,正常对照C57BL/6小鼠主动脉弓内壁未出现斑块。观察ApoE-/-小鼠与正常对照C57BL/6小鼠血生化结果,发现ApoE-/-小鼠总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均高于正常对照C57BL/6小鼠(p<0.05,n=3)。2、UCMSC鉴定采用组织贴壁法原代培养UCMSC。接种一周后有少量细胞从组织块周围爬出,两周后组织块周围爬满细胞,细胞为长梭形呈现涡旋形生长,培养至P3代时,观察到细胞形态为长梭形,明显呈涡旋状生长。诱导分化结果表明P3代UCMSC具有向骨细胞,软骨细胞和脂肪细胞诱导分化的潜能。流式细胞仪分析UCMSC表面抗原标记物CD34和CD45阳性比例分别为(1.6±0.32)%和(0.4±0.47)%,UCMSC表面抗原标记物CD73、CD90和CD105阳性比例分别为(99.8±0.35)%、(96.9±0.44)%和(92.0±0.34)%。3、治疗效果ApoE-/-小鼠高脂饲养6周构建动脉粥样硬化模型小鼠。UCMSC腹腔注射治疗动脉粥样硬化,治疗后第4周进行疗效评价,观察到治疗组和模型对照组相比心脏长径明显缩短(p<0.01,n=5),心脏体重比显著下降(p<0.01,n=5),且心室壁增厚明显变薄;治疗组小鼠主动脉弓斑块数量明显少于模型对照组;治疗组主动脉弓内膜病变程度较轻,弹性纤维较为完整;治疗组和模型对照组小鼠血脂水平相比,治疗组TC、TG、LDL-C水平明显降低,HDL-C水平明显升高,差异显著,具有统计学意义(p<0.05,n=15);治疗组小鼠心脏和肝脏中自噬相关基因(Atg14、Atg7、Becn1、Lc3b、sirt1、sirt5)转录水平相较于模型对照组明显上升;代谢组学分析发现在治疗组小鼠血浆代谢产物中磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)和神经酰胺(Ceramide,Cer)水平显著低于模型对照组(p<0.01,n=5),在肝脏代谢产物中发现PI水平在治疗组中低于模型对照组。[结 论]1、本次实验所购买ApoE-/-小鼠在高脂喂养6周后可建立动脉粥样硬化小鼠模型。2、组织贴壁法培养原代UCMSC方法可行,该方法操作简单,可批量获取UCMSC。分离纯化至P3代所得的UCMSC从形态、诱导分化潜能到表面抗原标记物的特征均与相关权威文献报道一致。3、动脉粥样硬化模型小鼠注射UCMSC治疗后,可显著抑制动脉粥样硬化斑块的形成;可明显改善血脂水平,表明UCMSC对动脉粥样硬化症具有积极的治疗作用。4、UCMSC可能是通过调节心脏和肝脏的自噬水平,改善肝脏代谢功能异常,抑制动脉粥样硬化斑块的形成而实现对动脉粥样硬化症的治疗作用。