研究背景股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH))早期诊断困难,致残率高,严重影响患者生活质量。激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)的发病率已上升到非创伤性股骨头坏死发病率的首位。相关的研究认为,糖皮质激素大剂量应用能够通过影响相关功能蛋白而影响骨循环内皮细胞的结构和功能,影响血管新生、血管舒缩性、凝血和纤溶性及内皮细胞氧化应激损害,导致血液循环功能障碍,引起骨组织发生缺血坏死。有研究表明淫羊藿苷(icariin,ICA)对缺氧、糖皮质激素刺激等引起的内皮细胞损伤及功能障碍有一定的保护作用。miRNA作为一个重要的基因调节因子,在生物体中发挥着重要的作用,相关研究已证实microRNA在ONFH的发病过程中起一定调控作用。本课题组前期体外实验已验证激素诱导股骨头骨微血管内皮细胞(bone microvascular endothelial cells,BMECs)损伤后可导致其miRNAs表达谱发生明显变化;淫羊藿苷对激素诱导股骨头微血管内皮细胞损伤后部分失衡miRNAs有一定的调控作用。由此我们推测淫羊藿苷可能通过调控相关miRNA的表达,来干预激素性股骨头坏死的发病过程。现阶段我们课题组通过动物体内实验进一步验证前期研究的观点及结论,进而来进一步探寻激素性股骨头坏死的发病及淫羊藿苷的防治机制。本研究经中日友好医院伦理委员会批准(实验动物使用许可证号:SYXK(京)2016-0043),所有实验程序均严格遵守《国际公约》和《赫尔辛基世界医学协会关于伦理原则宣言》的国际规则和规定。研究目的1.建立大鼠激素性股骨头坏死模型及评估淫羊藿苷对激素性股骨头坏死发生的预防作用。2.体内研究糖皮质激素对大鼠股骨头BMECs miRNAs表达谱的影响,探寻股骨微血管内皮细胞中可能存在与股骨头坏死相关的miRNAs;体内研究淫羊藿苷对大鼠激素性股骨头坏死股骨头BMECs差异表达miRNAs的调节作用,分析差异表达的miRNAs,探讨淫羊藿苷防治股骨头坏死的潜在作用靶点。研究方法1.选取8周龄雌性、健康SPF级SD大鼠30只,适应性饲养1周,采用随机数字表法对大鼠进行分组,每组10只,共3组,3组分为空白组、模型组及激素+淫羊藿苷干预组,每组10只。模型组:腹腔连续注射两次脂多糖(20μg/kg),每次间隔24h,末次注射脂多糖24h后双侧臀部肌肉交替注射甲强龙(40mg/kg),连续注射3次,每次间隔24h,24h后每日相同时间点给予等量生理盐水灌胃,连续灌胃4周。激素+淫羊藿苷干预组:腹腔注射脂多糖(20μg/kg),每次间隔24h,连续注射两次,24h后肌肉注射大剂量甲强龙(40mmg/kg),连续注射3次,每次间隔24h,末次注射大剂量甲强龙后24小时给予大鼠淫羊藿苷灌胃60mg/kg,每日相同时间点连续灌胃4周。空白组:与模型组及激素+淫羊藿苷干预组相同的时间点给予等量生理盐水腹腔注射、肌注、灌胃。每周称重一次,观察大鼠体重变化情况,4周后ELISA法检测大鼠血浆内皮素1(endothelin-1,ET-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)、纤溶酶原激活物抑制因子-1(plasminogen activatorinh ibitor-1,PAI-1)、组织型纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen aetivator,t-PA)、一氧化氮测定(nitric oxide,NO)含量。同时取大鼠双侧股骨头行病理苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,评估造模是否成功及淫羊藿苷对激素性股骨头坏死的发生是否有预防作用。2.取5只大鼠,联合应用机械震荡、酶消化及密度梯度离心法分离股骨头BMECs并培养,免疫荧光联合流式细胞仪对股骨头BMECs进行鉴定,测细胞生长曲线,行细胞管型实验评估内皮细胞功能。3.选取SPF级8周龄雌性SD大鼠15只,适应性饲养1周后,随机数字表法分为3组,空白组5只,模型组5只,激素+淫羊藿苷干预组5只。3组大鼠的给药方式及剂量同上述实验1。4周后随机从3组中每组各取2只大鼠行病理学检查;剩余3组大鼠每组3只均根据上述实验2部分行股骨头BMECs提取、培养,直至细胞覆盖培养皿80%后,提取总RNA,高通量测序法测定miRNA相对表达量。首先筛选模型组与空白组差异表达的miRNAs,行RT-PCR验证,分析其中可能与股骨头坏死相关的miRNA;根据模型组与空白组差异表达miRNAs的分析结果,选取其中可能与股骨头坏死发病相关的miRNA,观察其在空白组、模型组和激素+淫羊藿苷干预组中的表达变化趋势。对miRNA-335进行生物信息学分析。研究结果1..4周时模型组股骨头坏死发生率为90%,淫羊藿苷干预后股骨头坏死发生率为20%,差异有统计学意义(P=O.005)。前两周时三组大鼠体重无明显变化;第3周时三组大鼠体重出现差异,空白组大鼠体重最大,其次是激素+淫羊藿苷干预组,模型组大鼠体重最小;第4周时模型组大鼠体重与和空白组和激素+淫羊藿苷干预组大鼠体重之间差异有统计学意义,而空白组大鼠体重与激素+淫羊藿苷干预组大鼠体重之间差异无统计学意义。三组大鼠血浆ET-1、VEGF、TM及NO含量无明显差异;三组大鼠血浆PAI-1含量差异有统计学意义,淫羊藿苷对激素诱导机体PAI-1水平升高有调控的趋势。t-PA检测结果显示模型组大鼠血浆t-PA含量较空白组和激素+淫羊藿苷干预组明显升高,空白组和激素+淫羊藿苷干预组大鼠血浆t-PA含量无明显差异。2.大鼠股骨头BMECs经免疫荧光及流式双重鉴定,均高表达CD31和vWF,免疫荧光结果证实提取的细胞不表达CD133,该方法提取的内皮细胞纯度高、功能良好。3.经对模型组与空白组基因芯片检测结果分析发现,模型组4个miRNA表达量发生明显变化,其中2个表达上调(miR-132-3p和miR-335),2个表达下调(miR-466b-2-3p和let-7c-1-3p);淫羊藿苷可能对miR-335的表达有调控作用,miR-132-3p和miR-335表达量在空白组、模型组和激素+药物干预组均呈现先升高再下降的表达趋势。4.通过生物信息学对miR-335可能作用的靶基因进行Pathway和GO分析,miR-335作用的相关信号通路可能包括:其他类型的O-glycan生物合成、鞘脂类代谢、吞噬作用、调节肌动蛋白细胞骨架、细胞凋亡、其他多糖降解、Wnt signaling pathway、Calcium signaling pathway等,可能的靶基因功能包括:调控血管形成、调控分子的相关功能、细胞代谢、蛋白表达等。结论:1.淫羊藿苷对激素引起的大鼠股骨头缺血性坏死的有一定的预防作用。2.激素可能通过调控股骨头BMECs miR-335的表达来诱导股骨头坏死的发生。3.在激素性股骨头坏死发生的早期,机体本身可能通过上调股骨头BMECs miR-132-3p的表达来启动自身的修复机制。4.淫羊藿苷可能通过调控股骨头BMECs miR-335的表达来干预激素性股骨头坏死的发生。