据统计,全世界约10%~15%的夫妇受不孕不育的困扰[1],其中由单纯男性因素导致的不孕症占40%左右。研究指出,遗传因素占男性不育因素的15%-30%左右[2],参与影响不育的各种生理过程,包括激素稳态、精子发生和精子质量。因此,了解精子发生的遗传基础对于不孕不育夫妇治疗是至关重要的。在前期研究中,我们筛选到睾丸特异表达基因Tbc1d8,通过Crispr/cas9技术构建基因敲除模型,发现Tbc1d8敲除的雄性小鼠不育。因此本课题主要探讨Tbc1d8在精子生成与变形过程中的作用,并初步探讨其调控机制。通过检测成年小鼠卵巢、睾丸、附睾、心、肝、肺、肌肉、肾脏、小肠等多种组织中基因表达,筛选到一系列生殖特异基因。其中Tbc1d8基因在小鼠睾丸、附睾中特异表达,免疫组化以及免疫荧光显示该基因主要表达于睾丸间质细胞以及精原细胞。为了探究Tbc1d8基因在生殖系统可能发挥的作用,利用Crispr/cas9技术构建Tbc1d8基因敲除模式小鼠,通过生育力实验检测发现雄鼠不育。对Tbc1d8基因在雄性生殖系统的功能进行了初步探讨,实验结果显示:突变雄性小鼠睾丸体积小于对照组,HE染色发现睾丸生精小管内长形精子显著减少,附睾内精子数目减少;CASA分析精子活动力以及前向运动力丧失;精子涂片的HE染色显示突变小鼠精子头部、颈部畸形率明显增加,透射电镜技术分析发现精子头部存在异常。因此,Tbc1d8可能在精子变形过程中发挥了重要作用。结论:Tbc1d8在睾丸、附睾组织中高表达,并且参与精子变形过程,基因突变造成雄鼠不育。雌性哺乳动物卵子发生过程包含两个重要事件:原始卵泡的组装以及卵泡的发育。原始卵泡库于出生前后形成并构成雌性卵巢中的卵子储备。原始卵泡库的形成受到精密的转录与转录后水平的调控。近年来,随着非编码RNA功能研究深入,已经证明小分子非编码RNA-Micro RNA可以作为一种转录后调控因子,参与到原始卵泡组装过程中,但目前相关研究甚少。前期工作中通过文献检索,发现mi R-92b可能参与原始卵泡的形成,因此本课题主要探究mi R-92b在原始卵泡组装过程中的作用机制。通过实时荧光定量PCR检测mi R-92b在小鼠原始卵泡组装进程中表达上调。建立新生小鼠卵巢体外培养体系,通过转染mi R-92b mimics/inhibitor进行敲减以及过表达,观察原始卵泡组装情况。结果提示:抑制mi R-92b能够抑制生殖包囊破裂以及原始卵泡组装,原始卵泡占总卵泡数比例显著降低(p<0.05),卵泡发育相关基因表达降低,而过表达mi R-92b可以加速原始卵泡组装。通过数据库预测mi R-92b靶基因以及对靶基因进行GO分析以及信号通路预测发现,mi R-92b主要参与调控m TOR信号通路。双萤光素酶报告实验证明mi R-92b可以直接结合靶基因TSC1 3’非编码区(3’Untranslated Region,3’UTR)。且能负向调控卵巢内TSC1表达。体外转染TSC1 si RNA,能够加速原始卵泡组装。由此我们推测mi R-92b通过靶向TSC1进而调控p-RPS6信号通路,调控原始卵泡组装进程。结论:mi R-92b在原始卵泡组装期间高表达,通过负调控靶基因TSC1,进而激活p-RPS6,促进原始卵泡组装。