论文部分内容阅读
目的:建立体外培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)并加以鉴定,利用相关化学试剂的诱导分化作用,诱导BMSCs向神经细胞方向分化。以BMSCs为研究对象,实验验证亚低温通过上调BMSCs中SUMO化修饰水平增加细胞本身对缺血缺氧的耐受性。制备动物脑梗死模型,给予亚低温联合缺血半暗带BMSCs移植,验证亚低温通过上调细胞内SUMO化修水平饰改善脑梗死模型大鼠的神经功能。本研究旨在实验验证亚低温通过上调SUMO化修饰发挥细胞保护作用,旨在为探索亚低温联合干细胞移植治疗脑梗死打下理论和实验基础。方法:选择改良后的原代细胞贴壁法对提取的SD大鼠BMSCs进行培养,然后再用流式细胞术检测鉴定细胞表面标记蛋白,利用化学试剂法体外诱导其向神经细胞分化;在33℃和37℃两种温度条件下培养BMSCs,之后运用Western blotting方法对在不同的温度培养下BMSCs内的SUMO1和SUMO 2/3蛋白表达情况进行检测,细胞免疫荧光染色法检测SUMO1和SUMO2/3蛋白在细胞内的定位变化;利用RNA干扰沉默技术(siRNA)制备UBC9敲低的BMSCs(SiUBC9BMSCs),建立野生BMSCs和SiUBC9 BMSCs的氧糖剥夺(OGD)模型并分别给予常温37℃和亚低温33℃干预,Western blotting方法检测不同细胞分组和不同温度培养条件下SUMO1和SUMO2/3蛋白表达水平变化,检测每组细胞凋亡率变化和培养基中LDH浓度变化;线栓法建立SD大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,亚低温33℃联合BMSCs或SiUBC9 BMSCs梗死缺血半暗带区移植,观察大鼠神经功能恢复情况,盲法实施神经功能评价。结果:利用改良后的细胞贴壁法获取到体外培养大鼠BMSCs后,流式细胞术检测所培养细胞满足BMSCs相关特征,在体外化学试剂诱导下,体外培养的大鼠BMSCs能够表达神经胶质细胞标记蛋白以及神经元表面标记蛋白;Western blotting检测发现亚低温培养条件下SUMO1和SUMO2/3结合蛋白表达水平升高,细胞免疫荧光染色发现亚低温干预后SUMO1和SUMO2/3出现明显的细胞核内转移;OGD处理BMSCs后,Western blotting检测发现亚低温可明显促进SUMO1和SUMO2/3结合蛋白表达水平的升高,减少细胞凋亡率和LDH分泌,发挥出神经保护作用,这种细胞保护作用为SUMO依赖性的;成功制备大鼠脑梗死模型,亚低温条件下可增加移植到缺血半暗带BMSCs的存活率,亚低温联合BMSCs移植治疗可明显促进脑梗死后大鼠神经功能的恢复。结论:1.BMSCs在细胞条件培养基诱导下,可部分地表达神经元特异性蛋白NSE,大部分细胞表达神经胶质细胞标志蛋白GFAP。2.亚低温增加BMSCs中SUMO1和SUMO2/3与靶蛋白的结合,诱发SUMO浆核移位;SiUBC9抑制SUMO1和SUMO2/3在细胞乏氧状态下与靶蛋白的结合;亚低温可降低BMSCs在乏氧状态下的细胞凋亡比率和LDH分泌水平,发挥细胞保护作用,且这种作用为SUMO依赖性。3.亚低温联合BMSCs缺血半暗带移植能够提高移植区细胞的存活率,保护缺血半暗带区受损神经元,改善受损的神经功能,且这种作用为SUMO依赖性。4.亚低温对乏氧状态下BMSCs的保护作用与细胞内大量蛋白的SUMO化修饰密不可分,由此推测,增强靶蛋白SUMO化修饰可能是亚低温脑保护作用的分子机制之一。