食管癌在全球常见恶性肿瘤中排名第八位,是全球第六大癌症相关死亡原因,在中国发病率和死亡率均较高。鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(AC)是食管癌的两种主要组织学类型。在发达国家,食管腺癌约占食管癌患者的三分之二,而在发展中国家食管鳞状细胞癌(ESCC)占食管癌病例的90%。ESCC是中国主要的食管癌类型。尽管现代医学检测技术不断进步,但ESCC患者的总体死亡率仍然居高不下。ESCC具有家族遗传性的特点,在一些地区具有较高的发病率,特别是在中国北方的山西、河南与河北省接壤的地区。虽然已经确定一些肿瘤抑制因子和癌基因在ESCC发生和发展中起关键作用,然而,ESCC发生和发展的确切分子机制尚未阐明。人PTPN6基因位于染色体12p13上,编码相对分子量为68,000的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶。PTPN6基因被认为是血液和实体恶性肿瘤中的候选肿瘤抑制因子,且启动子区高甲基化可能是导致其表达下调的表观遗传学机制。然而,PTPN6的表达及其启动子甲基化状态在ESCC发病机制中的详细作用尚未完全阐明。基于以上研究背景,在本研究中,我们检测了PTPN6在ESCC组织和食管癌细胞中的表达,并分析其与患者临床病理资料及预后之间的关系。进一步检测了CpG岛高甲基化在PTPN6失活中的作用,旨在阐明PTPN6在ESCC发生和发展中的功能作用和预后意义。并通过体外过表达PTPN6基因,研究其对食管癌细胞体外增殖、迁移、侵袭能力的影响,进一步深入探讨PTPN6基因对食管癌细胞生物学行为的影响作用。主要研究分为以下三个部分。第一部分PTPN6在ESCC中的表达及其临床意义目的:检测不同食管癌细胞系、71例ESCC组织及相应癌旁正常组织中PTPN6的mRNA和蛋白表达水平,并分析其与ESCC恶性表型之间的关系,分析PTPN6蛋白表达与ESCC患者预后的关系。方法:1.研究对象人食管癌细胞系TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2由河北医科大学第四医院生物标本库保留并传代,以人食管上皮细胞(HEEpiC)作为对照;组织来源于河北医科大学第四医院胸外科2008年至2011年收治的原发性食管癌患者71例。每例组织均取癌组织原发灶及距癌旁边缘大于5cm处的癌旁正常组织作为正常对照。2.利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法和Western blot方法分别检测不同食管癌细胞系和对照组中PTPN6 mRNA和蛋白的表达水平。3.分别应用qRT-PCR和免疫组织化学方法分别检测ESCC和癌旁正常组织中PTPN6 mRNA和蛋白的表达水平。4.进行Kaplan-Meier生存曲线分析。按ESCC组织中PTPN6的蛋白表达情况分为PTPN6阳性表达组和阴性表达组。根据ESCC患者临床生存期资料分析PTPN6表达与ESCC患者总生存期的关系。结果:1.食管癌细胞系中PTPN6的mRNA及蛋白的表达情况PTPN6 mRNA在六株食管癌细胞中的表达量均显著低于对照组,并且在Eca109和Yes-2细胞中表达低于其它四株细胞。PTPN6蛋白在六株食管癌细胞中的表达显著低于对照组,并且在Eca109和Yes-2细胞中表达低于其它四株细胞。2.ESCC患者癌及相应癌旁正常组织标本中PTPN6的mRNA及蛋白表达情况qRT-PCR的方法检测ESCC及相应癌旁正常组织中PTPN6的mRNA表达情况,结果显示,71例ESCC组织中PTPN6 mRNA的表达量显著低于相应癌旁正常组织(1.000±0.001 vs 1.815±0.386,t=13.533,P<0.05)。应用免疫组化的方法检测71例ESCC及相应癌旁正常组织中PTPN6的蛋白表达,结果显示,PTPN6蛋白在ESCC组织中的阳性表达率显著低于相应癌旁正常组织[32.4%(23/71)vs77.55(55/71),χ~2=29.128,P<0.05]。ESCC组织中PTPN6的mRNA和蛋白表达与患者的TNM分期、肿瘤病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05),而与年龄、性别、浸润深度及上消化道肿瘤家族史无关(P>0.05)。1.PTPN6蛋白表达与ESCC患者临床预后的关系PTPN6蛋白表达与ESCC患者的生存期有关。在PTPN6蛋白阳性表达的ESCC患者中,5年生存率为39.1%,而PTPN6蛋白阴性表达组中5年生存率仅为18.4%(χ~2=3.391,P<0.05,Log-rank test)。小结:1.PTPN6的mRNA和蛋白在食管癌细胞系和ESCC组织中表达显著降低,且其mRNA和蛋白表达均与患者的临床病理特征有关,提示PTPN6基因可能与ESCC发生发展过程中的恶性表型相关。2.PTPN6的蛋白表达与ESCC患者的生存期显著相关,提示PTPN6可能作为判断ESCC患者预后的一个分子指标。第二部分ESCC中PTPN6第二启动子区P2甲基化状态检测及其与预后的关系目的:观察甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)药物处理前后PTPN6的mRNA和蛋白表达水平的改变,应用亚硫酸氢盐-基因组测序法(Bisulfite Genomie Sequencing,BGS)检测5-Aza-dC处理前后细胞PTPN6基因P2启动子区CpG位点甲基化频率的分布情况,并根据甲基化CpG位点的分布情况设计引物,应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)的方法检测PTPN6在ESCC中的甲基化状态,并进一步验证PTPN6表达下调与甲基化的关系。方法:1.细胞培养及药物处理选取三株PTPN6表达较低的食管癌细胞系常规培养,分别用浓度为5μmol/L的DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC对处于对数生长期的细胞进行处理,培养48小时,期间每24小时更换培养液一次,处理完毕后以完全培养基继续培养24小时收集细胞,用以后续的DNA、RNA及蛋白提取。2.利用qRT-PCR和Western blot的方法检测5-Aza-dC处理前后不同食管癌细胞系中PTPN6 mRNA和蛋白表达情况。3.利用亚硫酸氢盐基因组测序(bisulfite genomic sequencing,BGS)的方法检测3株不同食管癌细胞系5-Aza-dC处理前后PTPN6 P2启动子区CpG位点的甲基化情况。4.利用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction,MSP)的方法检测不同食管癌细胞系和ESCC及相应癌旁正常组织中PTPN6基因的甲基化状态。5.Kaplan-Meier生存曲线分析ESCC组织中PTPN6 P2启动子区甲基化阳性组和甲基化阴性组与ESCC患者总生存期的关系。结果:1.5-Aza-dC处理前后PTPN6 mRNA及蛋白的表达情况应用qRT-PCR方法检测5-Aza-dC处理食管癌细胞Eca109、Kyse170、Yes-2后PTPN6的mRNA表达情况,发现PTPN6表达明显上调。且Western blot的方法检测结果显示,其蛋白表达也明显上调。2.PTPN6 P2启动子区甲基化频率检测利用BGS的方法对-167bp到-326 bp的CpG位点进行了测序,结果显示,5-Aza-dC处理前食管癌细胞系中CpG位点的甲基化频率均高于相应处理后的食管癌细胞。3.5-Aza-dC处理前后PTPN6在不同食管癌细胞系中的甲基化状态应用5-Aza-dC处理前Eca109、Kyse170、Yes-2三株食管癌细胞均呈高甲基化状态,5-Aza-dC处理后Eca109和Yes-2细胞中PTPN6的甲基化程度均降低,表现为非甲基化状态。5-Aza-dC处理后PTPN6在Kyse170细胞中有非甲基化条带扩出。4.ESCC及相应癌旁正常组织中PTPN6 P2启动子区甲基化状态的检测PTPN6 P2启动子区在ESCC组织中的甲基化率为63.4%(45/71),显著高于相应癌旁正常组织(16.9%,12/71)(P<0.05)。并与ESCC患者的TNM分期、肿瘤病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05)。在PTPN6甲基化阴性组,其mRNA表达量显著高于PTPN6甲基化阳性组的mRNA表达量(P<0.05)。在PTPN6甲基化阴性组,其蛋白表达阳性率为65.4%(17/26),显著高于PTPN6甲基化阳性组的蛋白表达阳性率(13.3%,6/45),(χ~2=20.386,P<0.05)。5.PTPN6 P2启动子区甲基化与ESCC患者临床预后的关系PTPN6 P2启动子区甲基化与ESCC患者的生存期有关。在PTPN6 P2启动子区发生甲基化的ESCC患者中,5年生存率仅为15.2%,而该基因P2启动子区甲基化阴性组中5年生存率为42.3%(χ~2=5.383,P<0.05,Log-rank test)。小结:1.PTPN6 P2启动子区高甲基化可能是导致该基因表达下调的重要机制之一。2.PTPN6 P2启动子区甲基化可能作为食管鳞癌的预后因素,有望成为判断ESCC患者临床预后的检测指标之一。第三部分PTPN6对体外培养食管癌细胞系生物学行为的影响目的:构建PTPN6过表达载体pcDNA3.1-PTPN6,分别瞬时转染Eca109和Yes-2细胞,观察过表达PTPN6基因后对食管癌细胞体外增殖、迁移、侵袭的影响。方法:1.选取PTPN6相对表达最低的Eca109、Yes-2两株食管癌细胞系,应用瞬时转染表达载体pcDNA3.1-PTPN6和pcDNA3.1的方法分别转染Eca109和Yes-2细胞,并利用qRT-PCR的方法检测转染效率。2.MTS和克隆形成实验方法检测过表达PTPN6后对食管癌细胞增殖能力的影响。将处于对数生长期的转染后细胞分别接种于96孔板,测定各孔的吸光度值;将处于对数生长期的转染后细胞分别接种于6孔板,常规培养一周,结晶紫染色,并计算菌落数,检测细胞的增殖能力。3.划痕实验检测过表达PTPN6后对食管癌细胞迁移能力的影响。将处于对数生长期的转染后细胞分别接种于6孔板,培养24h后,用20μl移液器吸头垂直于孔底划一条直线,于显微镜下观察并测量细胞不同时间点的相对迁移距离。4.应用Transwell小室侵袭实验检测过表达PTPN6后对食管癌细胞侵袭能力的影响。将处于对数生长期的转染后细胞分别接种于加好Matrigel胶的上室中,常规培养24h后,染色固定,制成载玻片,显微镜下观察各组穿膜细胞数判断细胞的侵袭能力。结果:1.转染过表达载体pcDNA3.1-PTPN6后转染效率的检测在第一研究部分中,我们发现PTPN6在食管癌细胞系Eca109和Yes-2中表达最低。因此选取这两株细胞进行瞬时转染。应用qRT-PCR的方法检测转染后Eca109和Yes-2细胞PTPN6的表达量。结果显示,与Eca109细胞和转染了空载体的对照组相比,pcDNA3.1-PTPN6组的mRNA表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与Yes-2细胞和转染了空载体的对照组相比,pcDNA3.1-PTPN6组的mRNA表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。经检测在两株细胞的转染效率均高,可以进行后续功能试验。2.过表达PTPN6后对Eca109和Yes-2食管癌细胞系增殖能力的影响利用MTS和克隆形成实验检测过表达PTPN6对食管癌细胞增殖能力的影响。结果显示,过表达PTPN6基因后导致Eca109和Yes-2细胞的增殖能力明显下降(P<0.05)。3.过表达PTPN6基因后对Eca109和Yes-2食管癌细胞系迁移能力的影响采用划痕实验检测食管癌细胞的迁移能力,结果显示,过表达PTPN6基因后食管癌细胞Eca109和Yes-2的迁移能力明显降低(P<0.05)。4.过表达PTPN6后对食管癌细胞Eca109和Yes-2侵袭能力的影响利用Transwell小室侵袭实验检测食管癌细胞的侵袭能力,结果表明,过表达PTPN6能够抑制Eca109和Yes-2细胞的侵袭能力(P<0.05)。小结:PTPN6过表达后抑制食管癌细胞体外增殖、迁移及侵袭的能力,可能在食管癌的恶性进展过程中发挥重要作用。结论:1.PTPN6在食管癌细胞系及ESCC组织中表达下调与食管癌的发生及进展密切相关,且其P2启动子区高甲基化可能是导致该基因表达下调的重要机制之一。2.PTPN6蛋白表达及P2启动子区甲基化可作为ESCC患者独立的预后因素,有望成为ESCC患者预后评估的指标之一。3.PTPN6过表达后可能会抑制食管癌细胞体外增殖、迁移及侵袭的能力。