红花草莓红花基因RAPD分子标记的研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:siany
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红花草莓具有很高的观赏价值。本研究以红花草莓和栽培草莓杂交后代为试材,利用RAPD技术和BSA分析方法对后代的红花植株和白花植株进行DNA分子标记分析,并将获得的RAPD标记转化为SCAR标记,为利用分子标记技术辅助红花草莓育种、加快草莓育种进程提供了新的途径。主要结果如下:试验研究对比了3种提取红花草莓DNA的方法,并对5种不同部位提取的DNA进行了比较,结果用CTAB法从草莓嫩叶提取的DNA较完整、质量好,且浓度也较高。 通过对红花草莓红花基因RAPD反应中的一些重要参数进行优化试验,建立了一套适合红花草莓扩增反应体系:20μl反应体系中含有2μl10×Buffer,1.25mMMgCl2,0.125mMdNTP,1ng/μl基因组DNA,1UTaqDNA聚合酶(5U/μl),1ng/μl随机引物。扩增程序为:94℃预变性1min;94℃变性1min,38℃退火2min,72℃延伸2min,进行45个循环;最后72℃延伸5min。 得到3个红花草莓红花基因的RAPD标记即S484-620、AW65679-1031、S1383-500。共筛选520个引物,其中404个引物在鬼怒甘×粉红熊猫后代构成的DNA红花池和白花池之间都扩增出清晰的条带,有效引物比例为80%;有效引物中最多的可产生12个条带,最少的只产生1个条带,共扩增出条带数3512条,平均每个引物可扩增出5.6条谱带。两池之间表现稳定多态性的引物有96个;利用吐德拉×粉红熊猫后代构成的两种DNA池进行筛选,表现稳定多态性的引物有36个;再利用吐德拉、鬼怒甘、粉红熊猫对有差异的36个引物进行扩增,发现有7个引物在亲本间有差异谱带。但在打开池进行单株验证时,其中4个引物扩增的标记并不与红花基因连锁或连锁不紧密。而引物AW65679、S1383、S484产生的条带在红花池的各单株中存在,而在白花池的单株中不存在,片段大小分别约为1031bp、500bp、620bp。 用引物AW65679、S1383、S484对鬼怒甘×粉红熊猫后代的103单株进行扩增,交换率分别为10.85%、2.91%、11.65%,转化为Kosambi函数分别为10.85cM、2.91cM、11.86cM,对36个单株进行扩增,结果与田间花色鉴定的吻合率分别为80.56%、91.67%、77.78%。证明RAPD标记AW65679-1031、S1383-500、S484-620与红花草莓红花性状紧密连锁。 将与红花基因连锁的RAPD标记即AW65679-1031与S1383-500进行克隆与测序,片段精确大小分别为1038bp、515bp。并根据测序结果设计4对SCAR引物为AW1、AW2、AW3、S1。将这4对引物对红花草莓品种粉红熊猫、白花草莓品种鬼怒甘及它们的杂交后代进行PCR扩增、优化和鉴定,结果筛选出引物AW1可扩增出与红花基因连锁的特异片段AW65679(1038bp),是与红花草莓红花性状连锁的SCAR标记,该标记稳定性好,重复性高,在红花草莓分子标记辅助育种中具有广阔的实用性和应用前景。
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