非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)是一组组织形态和生物学特性各异的淋巴系统恶性肿瘤,是威胁人类生命的十大恶性肿瘤之一,也是发病率增长最快的恶性肿瘤。美罗华(Rituximab)作为一种嵌合抗体彻底改变了非霍奇金淋巴瘤的治疗状况,并且成为了目前最成功的抗肿瘤药物。单独使用Rituximab治疗复发以及难治的NHL缓解率可达50%左右,若与化疗药物联用,在一些NHL亚型中治愈率可达100%,并且副作用很小。2008年美罗华的销售额达到近60亿美元,具有极大的市场价值。美罗华取得成功的原因主要有两点:首先,美罗华是人鼠嵌合抗体,既保留了鼠源可变区的高亲和性,又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。在降低了人抗鼠抗体(HAMA)反应的发生率的同时,嵌合抗体作为完整抗体分子,在体内半寿期更长,并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。其次,NHL患者中约85-90%是B细胞淋巴瘤,而CD20是B淋巴细胞和B淋巴瘤细胞表面特有的膜表面蛋白,不表达于造血干细胞、祖细胞、正常浆细胞以及人体其它正常组织[1]。CD20在B细胞表面的表达非常稳定,在与抗CD20抗体结合以后不易脱落与内化[2]。抗体与CD20结合以后,通过诱导细胞凋亡以及ADCC、CDC作用发挥杀伤作用。即便如此在临床应用中,病人还是会产生抗体抵抗。并且人们逐渐开始认识到美罗华的局限性。研制新型的抗CD20抗体成为目前抗肿瘤药物的新热点,并且以提高人源化水平和提高与Fc受体亲和力为目前的主流方法,尤其是人源化程度更高的抗体在临床实验中已经取得了较好的效果。还有研究人员试图从CD20抗原方面入手,解决抗CD20抗体的局限性问题。但是CD20的功能一直都不能确定,甚至连其天然配体都难觅踪影。最初研究人员推测它有可能是一种钙离子通道,因为抗体和CD20结合以后,引起细胞膜内的钙离子流动。目前的研究显示,CD20有自身形成4聚体的趋势,这样推测CD20可能是一种膜表面受体,能起到传导细胞信号的作用[3]。但是其他研究显示了不同的结果:CD20本身并不是传导信号的主体,只是掺入到BCR介导的信号通路中,并抢夺一部分BCR的功能[4]。虽然这些肤浅的了解不足以揭开CD20功能之谜,但是这些研究都表明CD20功能与BCR关系最大。本课题在利用现有条件的基础上,通过定点突变原有抗CD20抗体基因构建合成新的抗CD20嵌合抗体。在寻找比美罗华杀伤效果更好或接近的抗CD20嵌合抗体的同时,以CD20与BCR的作用作为研究CD20功能的一个突破口,寻找到CD20天然的作用蛋白,指导开发出新抗CD20抗体。本课题以抗体功能和寻找抗原相互作用蛋白这两方面入手,寻找构建抗CD20抗体的新方向。该课题使用方法和取得的结果的主要是:1.获得了2种抗体基因,构建了哺乳动物细胞双基因表达载体。通过重叠延伸PCR修改原有抗CD20抗体基因合成新抗CD20抗体轻链和重链可变区。上述序列均测序正确后,将轻链连入pBudCE4.1上游多克隆位点后,再将重链可变区和本室原有的CH1和Fc段序列连入该载体下游多克隆位点。构建完成哺乳动物细胞双基因表达载体。2种抗体分别命名为20R和20S。2.获得了BCR各组分与EGFP融合表达载体。以BCR各组分完整序列为模板,以NCBI上BCR各组分的结构域划分为依据,PCR得出Igα胞外区,Igβ胞外区和IgM重链序列。测序正确后构建与EGFP融合表达载体。其中IgM分成3段构建,包括CH1+CH2, CH2+CH3,CH3+CH4,这些片段与EGFP融合表达载体则分别命名为IgM1, IgM2, IgM3。Igα胞外区和Igβ胞外区与EGFP融合表达载体命名为Igα和Igβ。3.在CHO-K1细胞中表达了抗体蛋白、纯化了表达产物并对其进行了初步鉴定。将构建完成的2种含有抗体基因的双基因表达载体转染至CHO-K1细胞中进行表达并挑取单克隆,以直接ELISA筛选出高表达的细胞株。转瓶扩大培养阳性克隆,以蛋白A亲和层析柱纯化得到目的蛋白,说明其含有人Fc段;BCA法测定纯化后蛋白浓度。SDS-PAGE检测显示,纯化蛋白的相对分子量大小约为150kD,与标准抗体分子大小一致并在凝胶成像系统软件Gel-Pro Analyzer分析纯化蛋白中完整的抗体蛋白含量近70%。结合BCA法测定的蛋白浓度,最后得出20R和20S这2种纯化蛋白中完整抗体的浓度为:120 mg/L和77 mg/L。4.两种方法验证抗体诱导细胞凋亡的能力(1)细胞凋亡试剂盒检测抗体诱导细胞凋亡。以CD20+细胞Raji、Ramous(均为Burkitt淋巴瘤细胞)检测表达抗体诱导CD20+细胞凋亡的能力;以人白血病细胞株HL60检测抗体与CD20-细胞凋亡的诱导能力。抗体蛋白以2μg/ml、5μg/ml、20μg/ml这3个浓度分别作用于Raji、Ramous细胞。最后结果显示这2种抗体均可诱导CD20 +细胞凋亡,并且有较明显的剂量依赖效应。而且对CD20-细胞的生长没有明显影响。说明这2种抗体具有特异诱导CD20+细胞凋亡的能力。(2)流式细胞技术检测抗体诱导的细胞凋亡。实验方法与细胞凋亡试剂盒检测抗体诱导细胞凋亡类似,但是细胞接种量扩大到3×106细胞/ml,并且在抗体作用的24小时后,只用PI单染细胞,并用流式细胞仪检测凋亡细胞的数量。结果显示这2种细胞均可诱导细胞凋亡,并且20R比20S在同等剂量下诱导细胞凋亡的能力高1倍多。5.嵌合抗体诱导的CDC效应的检测美罗华、20R和20S分别以2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml这3个浓度作用于2×106细胞/ml的Raji细胞。并设无抗体作用的阴性对照孔。其中实验组与阴性对照组各设3个副孔。在抗体与细胞孵育15分钟后,加入10%的未灭活的人血清,即引入补体。血清孵育30分钟后加入CCK8。当阴性对照组呈现橘红色后检测OD450nm吸光值。最后结果显示美罗华的杀伤效果最好,20R和20S次之。而且20R的杀伤效果大概为美罗华的66%左右,20S的杀伤效果不好。6.得到了5种表达目的基因与EGFP融合表达的293细胞。利用293细胞具有半贴壁和自动成团的趋势,在加压过程中反复挑选高表达的多克隆细胞团。用Westen Blotting检测表达状况。结果显示得到了表达Igα胞外区-EGFP、Igβ胞外区-EGFP、IgM1-EGFP、IgM2-EGFP、IgM3-EGFP这5种细胞。这些细胞表达的蛋白仍然用其载体的名字命名,分别为Igα、Igβ、IgM1、IgM2和IgM3。7. GST-Pull Down验证CD20相互作用蛋白为Igβ和IgM。将诱饵蛋白CD20-GST结合到GST Bind resin上,分别与Igα、Igβ、IgM1、IgM2、IgM3这5种细胞裂解液作用。离心、清洗数次并去掉上清后,用还原性Loading Buffer在100℃下洗脱resin,最后用Westen Blotting检测。最后结果显示CD20可以与Igβ和IgM的CH2区结合,与Igα和IgM3不结合。本课题合成了2种抗CD20嵌合抗体,对CD20+细胞有一定杀伤作用。其中20R有成为药物应用于临床的潜力。但是这2种抗体与目前应用于临床中最好的抗CD20抗体具有一定差距。说明,修改的一系列位点可能为抗CD20抗体结合CD20的关键部位,或者为Fab’特殊的结构为必需。这样以后若合成抗CD20嵌合抗体可以避开这些区域,并结合一些抗CD20抗体的临床实验,设计合成新的抗CD20嵌合抗体。在寻找CD20相互作用蛋白方面,本课题没有从大量的血液细胞膜表面蛋白中搜寻CD20相互作用蛋白。而是根据目前研究的状况,从BCR方面入手探讨CD20相互作用蛋白。发现了CD20可能与Igβ及IgM的CH2区作用。这样我们推测CD20所引起的细胞内钙离子流,极有可能就是BCR的部分功能。而且接下来可以利用Igβ和IgM的CH2区的序列特征设计新的抗CD20抗体,即用Igβ和IgM的CH2区这些人体内天然存在的蛋白构建抗体。这些抗体可能会达到更好的治疗效果和更小的副作用。本课题可能为抗CD20抗体的研制和CD20功能的继续探讨开辟了一个新的领域。