背景急性白血病是儿童常见的血液系统肿瘤，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)约占70％，大多数为B细胞系，T细胞系所占比例较少。联合化疗是当前主要的治疗方法，但化疗也有自身的缺点。单克隆抗体(单抗)是针对细胞表面某一抗原的抗体，具有特异性识别细胞表面抗原的作用。免疫毒素是将毒素与单抗通过某种方法偶联而成，通过单抗的靶向作用与肿瘤细胞结合，达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的，并减少对其他组织的损伤，明显地克服了化疗和放疗的缺陷，可大大提高肿瘤治疗效果。本实验室对CD19和CD20抗原在B系ALL细胞表面表达情况的研究表明，CD19在B系ALL细胞中的表达强而均一，几乎所有ALL细胞表面均有CD19的表达；而CD20则不然，它在B系ALL细胞中的表达不均一，提示CD19分子是研究治疗B系白血病较为理想的分子靶点。斑蝥素(Cantharidin, CTD)是斑蝥虫的主要药效成分，它对多种肿瘤细胞有很强的杀伤作用，但因其极强的非特异性细胞毒作用，限制了临床上的应用。去甲斑蝥素(Norcantharidin, NCTD)是斑蝥素的衍生物，消除了斑蝥素对泌尿系统的刺激作用，通过Fas／FasL途径、Caspase途径、线粒体途径和MAPK途径诱导细胞凋亡。去甲斑蝥素主要用于治疗消化道肿瘤如原发性肝癌、食管癌、胃癌等和白细胞减少症。国内大多数研究是研制不同的去甲斑蝥素制剂用于肝癌、胆囊癌等的临床治疗，靶向治疗仅见梁福佑等将去甲斑蝥素与单抗偶联用于治疗肝癌的报道，其他未见报道。去甲斑蝥素虽然对血液系统肿瘤细胞有很强的杀伤作用，但国内外均未见将其用于治疗血液系统肿瘤的报道，靶向治疗的研究更未见报道。ZCH-4-2E8(简称2E8)是本实验室自行研制并经国际鉴定和命名的新的抗人CD19单克隆抗体杂交瘤细胞株，本研究采用ZCH-4-2E8(简称2E8细胞)分泌的单克隆抗体(单抗)作为研究材料，将去甲斑蝥素和CD19单克隆抗体通过活泼酯法连接起来，制成免疫毒素，并研究其在体外的杀伤作用，和体内对白血病动物模型的作用，为其进一步进入临床试验奠定坚实的基础，具有十分重要的意义。材料与方法1、常规方法复苏和培养ZCH-4-2E8杂交瘤细胞和Nalm6细胞；采用改良Bouvet法纯化IgM型2E8单抗；SDS-PAGE鉴定单抗纯度；研究不同浓度的去甲斑蝥素对Nalm6细胞的杀伤作用。2、2E8-NCTD免疫毒素的研制：先合成活泼酯，再将活泼酯和抗体反应制备免疫毒素。将相同量的单抗和不同量的活泼酯反应制备免疫毒素(命名为IT3系列)，流式测定IT3系列对CD19抗原的识别能力，24孔板上测定IT3系列免疫毒素对0.1×10~5个Nalm6细胞的杀伤作用，确定抗体和活泼酯的最佳连接比。3、体外测定免疫毒素的靶向杀伤作用：先检测Nalm6细胞和K562细胞上CD19抗原位点的表达情况；再将合成的免疫毒素(命名为IT9-1)分别作用于Nalm6细胞和K562细胞，每孔0.5×10~5个细胞，总体积2mL，比较10μg／mL 2E8抗体、4.6μg／mL去甲斑蝥素NCTD、10μg／mL免疫毒素2E8-NCTD对两种细胞生长的影响；24孔板上比较15μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、2.5μg／mL、1.25μg／mL、0.625μg／mL免疫毒素(IT9-1)对2×10~4个Nalm6细胞的作用。4、建立急性白血病动物模型：连续2天腹腔注射环磷酰胺，24h后尾静脉注射Nalm6细胞5×10~6个／只，观察小鼠症状，记录发病日期，病理检查小鼠肝、脾、脑、心、肺、肾、胃、小肠、结肠、胰腺组织肿瘤细胞浸润情况。5、2E8抗体对晚期动物模型的研究：预处理及注射细胞数目同前，2周后，尾静脉注射2E8抗体，密切观察小鼠状况，比较小鼠生存时间的差异。6、2E8抗体对早期动物模型的研究：尾静脉注射Nalm6细胞5×10~6个／只，24h后，注射2E8抗体及免疫毒素，密切观察小鼠状况，比较小鼠生存时间的差异。结果1、SDS—PAGE电泳鉴定单抗纯度，抗体经二硫苏糖醇(DTT)还原后分为两条带，重链和轻链，重链(H)分子量约为79.0KDa，轻链(L)分子量约为23.7KDa，蛋白纯度高达99％以上。2、不同浓度的去甲斑蝥素(NCTD)对1×10~5个Nalm6细胞的作用：10μg／mLNCTD作用于Nalm6细胞72h活细胞数为0；5μg／mLNCTD作用96h时细胞数为0.47×10~5个；2.5μg／mLNCTD作用96h细胞数为11.17×10~5个。统计分析表明，48h、72h、96h时，10μg／mL、5μg／mLNCTD与对照组相比对细胞生长有明显影响(p＜0.001)，2.5μg／mL、1.25μg／mL、0.625μg／mL、0.5μg／mL与对照组相比，各个时间点均无统计学差异。3、抗体和活泼酯最佳连接比例的测定：将相同量的抗体和不同量的活泼酯反应生成免疫毒素(命名为IT3系列)，FCM测定IT3系列免疫毒素对Nalm6细胞的阳性率均为99％以上，同时测定它们对细胞的杀伤能力。IT3-3作用于Nalm6细胞120h的抑制率为35.00％，IT3-4作用120h的抑制率为74.45％；IT3-1、IT3-2和对照组相比，各个时间点对细胞生长无抑制作用(p＞0.05)；与对照组相比，IT3-4在各个时间点对细胞生长均有明显影响(p＜0.005)，表明46μg抗体和0.01mmol／mL的活泼酯20μL反应所生成的的免疫毒素既有识别抗原的能力，又可最大程度的杀伤肿瘤细胞。4、免疫毒素体外杀伤作用的研究4．1、Nalm6细胞和K562细胞CD19的表达情况：2E8培养上清在Nalm6细胞上阳性率为99.34％，而在K562细胞上阳性率为0.98％。4．2、免疫毒素2E8-NCTD、2E8抗体及NCTD对Nalm6细胞的体外杀伤作用：统计分析表明，4.6μg／mLNCTD对0.5×10~5个Nalm6细胞96h抑制率为97.62％，10μg／mL 2E8—NCTD作用96h的抑制率为71.25％。统计表明：24h时各组之间无明显差异；48h、72h、96h、120h时，NCTD、2E8-NCTD与对照组相比对细胞生长影响均有统计学差异(P＜0..001)；在这些时间点上，2E8抗体与对照组无明显差异(p＞0.05)；72h、96h、120h时，NCTD与2E8-NCTD相比有明显差异(p＜0.05)。5．3、免疫毒素2E8—NCTD、2E8抗体及去甲斑蝥素对K562细胞的体外杀伤作用：4.6μg／mLNCTD作用于0.5×10~5个K562细胞96h活细胞数为0.17×10~5个，10μg／mL2E8-NCTD作用96h活细胞数为10.13×10~5个。统计表明：24h时各组之间无明显差异，48h、72h、96h时，2E8抗体、2E8-NCTD与对照组相比均无明显差异(p＞0.05)，在这些时间点上，NCTD与对照组相比均有统计学差异(p=0.000)。5．4、不同浓度的2E8-NCTD(命名为IT9-1)对Nalm6细胞的作用：96h时，15μg／mLIT9-1对Nalm6细胞的抑制率是95.52％，10μg／mL的抑制率是76.13％，2.5μg／mL的抑制率是19.39％。15μg／mL、10μg／mL和5μg／mL与对照组相比，各个时间点对细胞生长影响均有统计学意义(p＜0.005)；72h、120h、144h时，2.5μg／mLIT9-1与对照组相比，对细胞生长影响有统计学差异(p=0.000)，其他浓度组与对照组相比各个时间点均无统计学差异。6、急性白血病动物模型的建立小鼠注射肿瘤细胞后平均19.4±0.55天后肢行动迟缓，迅速发展为双后肢瘫痪，随着病情进展，小鼠严重消瘦，体重下降较快，并伴有脊柱侧弯，弓背，呈恶病质，直至最后死亡。病理检查结果表明，骨髓、肝、脾、肾、肺、卵巢、脑膜、脑实质内都有肿瘤细胞浸润，而心肌、胃、小肠、结肠粘膜下层未发现肿瘤细胞。7、2E8抗体对晚期模型的作用：模型组、PBS组、抗体组小鼠中位发病时间均为19天；模型组中位死亡时间是25天(21-28天)，PBS组中位死亡时间30天(19-31天)，抗体组中位死亡时间30天(23-32天)，抗体组小鼠发病及死亡时间与模型组、对照组相比，无统计学差异(P＞0.05)。8、抗体及免疫毒素对早期模型的作用：PBS组小鼠中位发病时间29天，2E8抗体组中位发病时间29天，免疫毒素组中位发病时间是27天。PBS组、免疫毒素组小鼠发病时间和死亡时间与PBS组相比，无统计学差异(p＞0.05)。结论1、成功制备并纯化了2E8抗体，采用活泼酯法成功制备2E8-NCTD免疫毒素，该免疫毒素在体外有较好的靶向杀伤作用。3、利用裸鼠成功建立了急性B淋巴细胞系白血病动物模型。4、免疫毒素2E8-NCTD、2E8抗体体内抗肿瘤作用进行了初步观察，但所获结果并非十分理想，有待于进一步研究。