研究背景卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的一种,早期卵巢癌患者缺乏典型的症状,且早期缺乏有效可靠的诊断指标,大部分患者在就诊时已处于晚期阶段,发生了局部或远处转移。据统计,2019年美国预计有22530例新诊断卵巢癌病例,13980例死亡病例。90%的卵巢癌是上皮性卵巢癌,最主要的组织学类型是浆液性。卵巢癌的治疗以手术及术后放化疗为主的综合治疗为主,但卵巢癌对传统化疗药物有很强的耐药性,导致复发率居高不下,患者5年生存率不足40%,极大地降低了卵巢癌患者的生活质量。近年来分子靶向药物开始用于卵巢癌的临床治疗,但部分患者出现对靶向药物的耐药性。对传统化疗药物耐药性的研究已取得初步进展,但对于新型靶向药物耐药性的研究还知之甚少,因此探究靶向药物耐药性的机制与如何改善的研究受到人们广泛关注。近年来BRD4蛋白已成为多种癌症的治疗靶点,针对BRD4溴结构域的抑制剂JQ1在多种癌症中表现出良好的抗肿瘤作用。溴结构域蛋白4(bromodomain containing 4,BRD4)是溴结构域与超末端结构域(bromodomain and extraterminal domain,BET)家族中研究最多的成员之一,它可以通过识别组蛋白H3与H4中的乙酰化赖氨酸残基引起染色质结构重塑,调控DNA的复制与转录等过程。JQ1是BET家族的小分子抑制剂,可以竞争性结合BRD4中的溴结构域,使BRD4蛋白不能有效结合到乙酰化的赖氨酸残基,从而干扰BRD4进而影响DNA的转录等生物学过程。已经在多种肿瘤中发现JQ1的抗肿瘤效应,但也有文献报道部分肿瘤对JQ1产生了一定的耐药性。自噬通过分解细胞器与蛋白质等物质进行再次利用,并产生能量。自噬对于内环境的稳态起着重要作用,但自噬对肿瘤发生发展具有双重作用。自噬一方面可以通过清除衰老与损伤的细胞器抑制肿瘤生长,另一方面自噬可以介导细胞内代谢产物的再次利用为肿瘤生长提供能量,促进肿瘤生长。特别是在饥饿、抗肿瘤药物等环境的刺激下,自噬可发挥保护作用,满足应激条件下肿瘤细胞代谢的物质能量需求。自噬在耐药性的研究中已逐渐成为肿瘤多药耐药(MDR)的一种机制。JQ1在部分癌症研究中可诱导产生自噬,因此,抑制自噬可能是克服卵巢癌对JQ1耐药性的有效途径。研究目的:探究卵巢癌是否对BET抑制剂JQ1产生耐药性,并探究耐药性的产生机制及寻找改善甚至逆转耐药性的方法。研究方法:1.检测JQ1作用后卵巢癌细胞系活性的变化:分别用MTT法与PI/Annexin-V流式细胞仪检测凋亡法检测BET抑制剂JQ1对卵巢癌细胞系增殖能力及凋亡的影响。2.JQ1作用后对卵巢癌细胞自噬水平的影响:Western-Blot检测JQ1作用后自噬相关蛋白表达水平的变化、免疫荧光试验检测内源性LC3B,AO染色法检测酸性自噬溶酶体。3.探讨自噬抑制剂与JQ1联用对卵巢癌细胞生物学行为的影响:JQ1分别与自噬抑制剂3-MA或CQ联用后,应用MTT法、平板克隆实验及流式细胞仪检测药物联用后对卵巢癌细胞活性的影响。Western blot检测自噬相关蛋白表达水平的变化。4.检测JQ1对AKT/mTOR自噬通路相关蛋白的影响:应用Western Blot实验检测JQ1作用后,细胞中AKT/mTOR通路相关蛋白的表达如AKT,phosphorylated AKT(p-AKT),phosphorylated mTOR(p-mTOR),phosphorylated P70S6K(p-P70S6K)等的表达变化。5.过表达AKT激活AKT/mTOR通路进行“回复复实验”:在卵巢癌细胞系中瞬时转染AKT质粒构建AKT过表达卵巢癌细胞模型,以转染阴性对照序列(negative control,NC)的细胞作为对照,应用Western Blot实验检测其过表达效率及对AKT/mTOR通路相关蛋白的影响。应用Western Blot及免疫荧光实验检测JQ1作用后自噬水平的变化。流式细胞仪检测JQ1对AKT过表达卵巢癌细胞系及NC细胞系凋亡水平的影响。6.检测JQ1与自噬抑制剂CQ联用对裸鼠卵巢癌异种移植瘤生长的影响:应用正常A2780卵巢癌细胞系构建裸鼠皮下成瘤模型,分为空白注射组、单用JQ1注射组、单用JQ1注射组及联合用药组,隔三日腹腔注射药物,隔日测量瘤径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,剥离瘤体后称量瘤体体积和重量,进一步验证JQ1与自噬抑制剂CQ联用对移植瘤生长的影响研究结果:1.JQ1对卵巢癌细胞系生长抑制作用的研究JQ1处理48h后,卵巢癌细胞的增殖能力明显降低,呈浓度依赖性。JQ1在作用 48h后对A2780、HO8910、SKOV-3、HEY四种细胞系的IC50分别为6.963uM、5.18uM、1.503uM、0.503uM(图 1A)。不同浓度的JQ1作用48h后对细胞进行PI/Annexin V染色,流式细胞仪检测凋亡水平。结果显示:JQ1作用48h后,四种卵巢癌细胞系的凋亡水平都明显增加,差异有统计学意义(图1B、1C)。Western Blot分析JQ1作用后四种卵巢癌细胞系BRD4蛋白及c-Myc的变化,结果显示:JQ1作用后,四种卵巢癌细胞系的BRD4及c-Myc表达水平均明显下调,且四种细胞系BRD4及c-Myc基础表达量没有明显差异(图1D、1E)。2.JQ1诱导耐药组细胞自噬作用的研究检测JQ1作用后四种细胞系LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的变化。结果表明:一定浓度的 JQ1(2.5uM)作用 48h 后,在 A2780 及 HO-8910 细胞系中,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值明显增加,在SKOV-3及HEY内无此变化(图2A),差异有统计学意义。Western Blot检测JQ1作用后细胞自噬标志物蛋白水平的变化。结果显示:自噬标志物ATG5、Beclinl及LC3-Ⅱ的表达水平在卵巢癌耐药组显著增加,SQSTM1表达水平显著下降,且呈浓度依赖性,卵巢癌敏感组则无此变化(图2B),差异有统计学意义。细胞免疫荧光实验及AO染色进一步证实JQ1作用后耐药组细胞内内源性LC3 puncta密度增加及酸性细胞器(AVO)增加(图2C、2D),表明JQ1引起耐药组自噬水平增加。使用CQ阻滞自噬溶酶体降解后应用JQ1,耐药组细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值仍然增加(图3A),表明JQ1诱导自噬增强是增加了自噬流的形成。3.JQ1与自噬抑制剂联合应用显著增强JQ1的抗肿瘤作用自噬起始抑制剂3-MA处理耐药组细胞系,再应用JQ1。使用Western Blot检测自噬标志物,结果显示,3MA与JQ1联用组与单用JQ1组相比,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著下调(图3A)。3-MA或CQ与JQ1联用后,耐药组中Cleaved-PARP表达上调,而在敏感组中则无此变化(图S1A)。MTT法检测自噬抑制剂3-MA和CQ与JQ1联用后JQ1对卵巢癌耐药组细胞的抑制增殖能力的变化。联用自噬抑制剂组与单用JQ1组相比,卵巢癌细胞系的增殖能力显著降低(图3C),差异有统计学意义。选用相同浓度的自噬抑制剂进行平板克隆实验,结果显示,单独应用JQ或自噬抑制剂对耐药组卵巢癌细胞集落形成能力无明显影响(图3B)。JQ1与自噬抑制剂联用后显著降低了集落形成能力。分别设立空白对照组、单用JQ1组、单用自噬抑制剂组与联用组,流式细胞仪检测凋亡变化进一步验证自噬发挥细胞保护性作用,。与MTT结果相一致:JQ1与自噬抑制剂联用后显著增强凋亡水平(图3D)。4.JQ1诱导自噬的分子机制的研究我们为探究AKT/mTOR通路是否参与JQ1诱导产生自噬,western blot检测不同浓度JQ1作用后AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平的变化。结果表明,JQ1作用后,JQ1耐药细胞组中AKT/mTOR通路相关蛋白p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K均显著下调,呈浓度依赖性(图4A及S1A),且差异具有统计学意义(P<0.05)。而在JQ1敏感细胞组中无此变化(图S1B)。证明JQ1作用后引起AKT/mTOR通路的失活。5.激活AKT/mTOR通路增加耐药组细胞对JQ1敏感性的分子机制的研究转染AKT质粒后p-AKT、p-mTOR及p-P70S6K表达上调(图S1C),证明AKT/mTOR通路被激活。细胞顺转AKT质粒与NC质粒,JQ1作用后,AKT质粒组与空白组相比,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著下调(图4C),证明AKT/mTOR通路的激活抑制了 JQ1诱导耐药组细胞自噬。进一步使用AKT通路抑制剂LY294002验证AKT/mTOR通路诱导自噬的参与(图4D)。同样分组进行细胞免疫荧光实验检测细胞内源性LC3B puncta的密度,进一步证实AKT/mTOR通路参与JQ1诱导产生自噬(图4B)。进行rescue实验:设立分组:空质粒对照组、空质粒+JQ1组、AKT1质粒组及AKT1质粒+JQ1组,选取一定浓度JQ1用流式细胞仪检测凋亡水平变化,结果显示:AKT1质粒组与空白质粒组相比,凋亡水平显著上调(如图4E),进一步证实AKT/mTOR通路的失活参与了细胞保护性自噬的产生。6.JQ1与自噬噬抑制剂在裸鼠移植瘤中协同抗肿瘤作用的研究裸鼠皮下接种正常A2780细胞系构建卵巢癌皮下异种移植瘤模型,接种后14天裸鼠皮下有米粒大小质韧的结节形成。隔三日腹腔注射药物,隔天测量一次肿瘤的长径和短径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。结果显示:药物联用组生长抑制作用最明显(图5A)。处死裸鼠后分离瘤体称量,结果显示药物联用组的肿瘤重量明显低于对照组(图5B和5C),且无明显毒性(图5D)。研究结论:1.JQ1通过诱AKT/mTOR通路失活介导卵巢癌细胞产生自噬。自噬对卵巢癌细胞具有保护作用,参与卵巢癌细胞对JQ1产生耐药性。2.联合应用自噬抑制剂与JQ1能显著增强JQ1的抗肿瘤作用,提高卵巢癌细胞及裸鼠移植瘤对JQ1的敏感性课题的创新性和局限性课题的创新性:1.研究了 BET抑制剂JQ1对卵巢癌细胞系的抗肿瘤作用:发现JQ1诱导自噬是部分卵巢癌细胞系对JQ1产生耐药性的潜在机制。2.体外实验证实AKT/mTOR通路的失活参与JQ1诱导卵巢癌细胞系自噬;“回复实验”证实AKT/mTOR通路失活诱导自噬是卵巢癌细胞系对JQ1产生耐药性的潜在机制。3.体内及体外实验验证了自噬抑制剂3-MA或CQ与BET抑制剂JQ1联用具有协同抗肿瘤作用。课题的局限性:1.本课题根据四种卵巢癌细胞系对JQ1敏感性不同分为JQ1敏感组与JQ1耐药组,而未培育JQ1耐药细胞系进而与父代敏感细胞作比较,说服性略差。2.论文对JQ1敏感组关注不足,部分实验并未同样在JQ1敏感组中验证,逻辑性有所欠缺。