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研究背景脑胶质瘤是源自神经上皮的肿瘤,占颅脑肿瘤的40%～50%,是最常见的原发性颅内肿瘤。年发病率为3～8人/10万人口。尽管近年来手术治疗、化疗和放疗等治疗手段均取得了进步,但因其具有侵润生长、分化差、增殖快、侵袭性强等特点,治疗效果仍不尽人意。恶性胶质瘤患者平均5年生存率仅为10%,平均生存时间仅1年左右。胶质瘤的高侵袭性及恶性增殖是影响预后的重要因素,对增殖及侵袭机制的研究和寻找有效的干预措施是提高胶质瘤预后的重要措施。胶质瘤代谢影响着胶质瘤的方方面面,目前研究较多的有:有氧糖酵解、谷氨酰胺、一碳代谢、磷酸戊糖通路和脂肪酸从头合成等。代谢可诱导肿瘤细胞重编程,与肿瘤微环境、脂质代谢、糖代谢、表观遗传和免疫等均密切相关。代谢酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(PFKFB4)在控制细胞糖代谢方面起着关键作用。研究表明PFKFB4在包括胶质母细胞瘤在内的多种人类肿瘤中均存在表达量增加,且其高表达促进肿瘤细胞的增殖和存活。在原发性胶质母细胞瘤中,PFKFB4的高表达与患者的预后不良有关,但其在参与胶质瘤糖代谢重编程过程的作用仍不清楚。本研究通过验证PFKFB4在胶质瘤中的表达及其与患者预后关系的基础上,发现PFKFB4通过影响胶质瘤细胞的增殖而影响胶质瘤的预后,进一步阐明了 PFKFB4通过促进过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活剂1α(PGC-1α)介导的线粒体生成而影响胶质瘤增殖的新机制。[目的]研究PFKFB4对脑胶质瘤中的表达情况及对预后的影响;通过研究PFKFB4对脑胶质瘤细胞增殖、线粒体生成的影响,明确PFKFB4在脑胶质瘤增殖及线粒体适应性改变中的作用,并探讨其中可能的机制。[方法]1.根据GEPIA和CGGA数据库,分析PFKFB4在正常脑组织和胶质瘤组织中表达情况及与胶质瘤预后明显相关;收集临床标本,通过Western blot检测PFKFB4的表达差异。Western blot检测PFKFB4在正常人小脑星形胶质细胞(Hac)与胶质瘤细胞(U87和T98G)之间的表达差异。2.应用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测胶质瘤U87细胞株及干扰株细胞活力,BeyoClickTM EdU-555细胞增殖检测试剂盒检测两株细胞增殖情况。3.Mito-Tracker Red CMXRos染色实验评价胶质瘤细胞中干扰PFKFB4对线粒体质量的影响。提取细胞DNA,通过Real Time PCR分析mtDNA copy number的变化以及线粒体DNA编码基因(NRF1、TFAM、TFB1M)的mRNA水平。Western blot实验与免疫沉淀实验检测组蛋白乙酰基转移酶5(GCN5)与PGC-1α的表达以及PFKFB4对PGC-1 α乙酰化修饰的影响。[结果]1.根据GEPIA和CGGA数据库分析显示,与正常组织相比,胶质瘤组织的PFKFB4表达明显上调(p<0.05),且Ⅳ级胶质瘤的表达量显著增高(p<0.001)。根据CGGA数据库分析,初次诊断的胶质瘤患者PFKFB4相对表达水平与胶质瘤预后明显相关(p<0.001)。临床标本Western blot检测提示PFKFB4在正常脑组织和胶质瘤组织中均有表达,而胶质瘤组织中的表达量明显高于正常脑组织。PFKFB4在人胶质瘤细胞株(U87、T98G)中的表达量显著高于正常人小脑星形胶质细胞株(Hac)。以上结果表明PFKFB4的表达水平可作为评估胶质瘤预后的有效指标。2.CCK8增殖检测结果提示干扰PFKFB4表达明显抑制胶质瘤细胞的活力(P<0.05)。干扰PFKFB4的表达明显降低EDU阳性细胞的比例(P<0.05)。综上所述,胶质瘤细胞中干扰PFKFB4的表达可抑制肿瘤增殖。3.稳定干扰U87细胞PFKFB4表达后,线粒体的质量、线粒体DNA拷贝数和线粒体DNA编码基因(NRF1、TFAM、TFB1M)的mRNA水平均明显降低。以上结果表明胶质瘤细胞中干扰PFKFB4降低了线粒体生成的能力,导致了能量产生的缺陷。胶质瘤细胞中干扰PFKFB4的表达,对PGC-1 α的表达无明显影响(P>0.05),但诱导了乙酰转移酶GCN5的表达上调(P<0.05),进而通过乙酰化修饰抑制了 PGC-1 α生物学活性。在稳定干扰PFKFB4表达的U87细胞中,GCN5表达的升高,检测到PGC-1α乙酰化水平的明显升高(P<0.05)。该结果表明PFKFB4表达降低诱导GCN5上调导致PGC-1α介导的胶质瘤细胞线粒体生成水平下降可能是抑制细胞增殖的原因之一。[结论]综上所述,PFKFB4在胶质瘤组织中普遍高表达,初次诊断的胶质瘤患者PFKFB4相对表达水平与胶质瘤预后明显相关,表明在胶质瘤中PFKFB4的表达水平可作为评估胶质瘤预后的有效指标。干扰PFKFB4表达可明显降低胶质瘤U87细胞的体外增殖。机制研究发现U87细胞中干扰PFKFB4表达可明显降低线粒体生成的水平。稳定干扰PFKFB4后PGC-1α的表达没有明显改变,但乙酰转移酶GCN5的表达明显升高,且随着GCN5表达的升高,PGC-1α乙酰化水平的明显升高,导致其生物活性降低。表明PFKFB4表达降低诱导GCN5上调导致PGC-1α介导的胶质瘤细胞线粒体生成水平下降可能是抑制胶质瘤细胞增殖的原因之一,脑胶质瘤可能通过PFKFB4诱导GCN5表达下调,增强PGC-1α介导的线粒体生成促进脑胶质瘤增殖。通过本研究,阐明了 PFKFB4影响胶质瘤增殖的新机制,对探索胶质瘤的靶向治疗和改善患者预后具有积极意义。