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前言乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一,发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%。近年来,乳腺癌的治疗也有了突飞猛进的发展,其中,术后化疗和新辅助化疗的应用越来越普遍,并显示了较好的疗效,但随之产生的患者对化疗药物的耐药也成为肿瘤治疗的一大难题。肿瘤的多药耐药问题是临床化学药物治疗肿瘤中的一大瓶颈,且耐药肿瘤细胞侵袭转移能力增强,缩短患者生存期。研究肿瘤多药耐药和侵袭转移相关的分子机制,寻找能对其进行干预的靶蛋白,阻止肿瘤多药耐药和侵袭转移的产生,对指导临床化疗具有重要意义。本课题将分别在耐药及药物敏感乳腺癌细胞中探讨参与化疗耐药、促进肿瘤侵袭转移的相关分子机制,并探索改善化疗效果的潜在作用靶点。故该课题的研究不仅对了解肿瘤的生物学特性具有明显的理论意义,也具有显著的临床价值和社会效益。第一部分CD44/PrPc相互作用及其对人耐药乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响目的研究人耐药乳腺癌细胞中CD44与PrPc的相互作用,及其对肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖能力的影响。方法采用Real-time PCR和Western Blot方法,从基因和蛋白质水平检测CD44和PrPc在耐药及药物敏感癌细胞中的表达情况；采用激光共聚焦显微镜和免疫共沉淀技术,检测耐药乳腺癌细胞MCF7/Adr中CD44与PrPc的定位和相互结合情况；采用siRNA干扰CD44或PrPc后,用Western Blot检测CD44、PrPc、 EGFR、CD147和MMPs蛋白的表达情况；采用transwell小室,检测干扰后MCF7/Adr的迁移侵袭能力的改变；采用生长曲线法检测CD44和PrPc对细胞增殖的影响。结果CD44和PrPc在耐药乳腺癌细胞MCF7/Adr和耐药小细胞肺癌H69AR中高表达,在亲本细胞MCF7和H69中低表达或不表达。在MCF7/Adr中,CD44和PrPc共定位于细胞膜上,并存在相互结合。siRNA干扰CD44或PrPc表达后,MCF7/Adr的迁移、侵袭和增殖能力减弱,并伴随着EGFR、CD147、MMPs以及细胞周期相关蛋白的改变。小结在耐药乳腺癌细胞MCF7/Adr中,CD44和PrPc存在相互结合,且干扰CD44或PrPc后,细胞迁移、侵袭和增殖能力也下调。第二部分CD44/PrPc对人乳腺癌细胞化疗耐药的影响目的明确CD44/PrPc与人乳腺癌细胞化疗耐药之间的关系及其机制。方法在耐药乳腺癌细胞株MCF7/Adr及其亲本细胞株MCF7培养过程中,加入不同剂量的P-gp底物类化疗药和非P-gp底物类化疗药,检测CD44和PrPc表达水平的改变；siRNA干扰MCF7/Adr中CD44表达后,再加入不同剂量的P-gp底物类化疗药(紫杉醇)以及非P-gp底物类化疗药(博莱霉素)孵育,应用transwell小室检测细胞侵袭能力的改变,Western Blot检测CD44、PrPc、 EGFR、CD147表达情况；siRNA干扰MCF7/Adr中CD44或PrPc的表达后,检测多药耐药相关蛋白P-gp、MRP1、ABCG2的表达。结果加入不同浓度的P-gp底物类化疗药后,多药耐药细胞株MCF7/Adr的CD44和PrPc蛋白水平显著上调,且这种作用不具有剂量依赖性,而药物敏感细胞株MCF7则没有相应的变化。干扰CD44表达后加入紫杉醇,随着剂量的增加,细胞侵袭力由抑制转为增强,CD44、PrPc、EGFR和CD147的表达也由少增多；而加入不同剂量的博来霉素,细胞侵袭力保持抑制状态。干扰MCF7/Adr中CD44或PrPc的表达后,P-gp的表达下调,而MRP1、ABCG2的表达没有显著改变。小结在耐药乳腺癌细胞MCF7/Adr中,加入P-gp底物类化疗药能显著上调CD44和PrPc的表达,干扰CD44表达后能抑制低浓度紫杉醇诱导的侵袭,但不能抑制高浓度紫杉醇诱导的侵袭。第三部分新辅助化疗前后人乳腺癌组织中CD44和PrPc的表达及其与临床化疗的关系目的探讨新辅助化疗前后人乳腺癌组织中CD44和PrPc表达的差异及其与临床化疗的关系方法采用免疫组织化学的方法在98例人乳腺癌组织标本(包括49例新辅助前穿刺标本和49例新辅助化疗后大体标本)中,研究CD44和PrPc的表达及其与临床化疗的关系。结果CD44主要表达在细胞膜,而PrPc主要表达在细胞核；新辅助化疗后的49例乳腺癌标本中,CD44的表达与PrPc的表达具有相关性,经Pearson’s相关分析,两者的相关系数r=0.411,P=0.003；而新辅助化疗前的49例乳腺癌标本中,CD44的表达与PrPc的表达不具有相关性,经Pearson’s相关分析,两者的相关系数r=0.095,P=0.519；22例新辅助化疗无效的病例,与化疗前相比,其化疗后乳腺癌组织中CD44和PrPc的表达显著升高(P=0.040,P=0.007)；而27例新辅助化疗部分有效的病例,与化疗前相比,其化疗后乳腺癌组织中PrPc的表达显著降低(P=0.014),CD44的表达则无明显差异(P=0.669)。小结人乳腺癌组织中CD44和PrPc的表达与临床新辅助化疗的效果有关,新辅助化疗效果差的化疗后乳腺癌组织中CD44和PrPc的表达显著升高。第四部分miR-130a在人耐药乳腺癌细胞中的初步研究目的研究miR-130a在耐药细胞株及其亲本细胞株中表达水平是否存在显著差异,预测miR-130a作用的靶基因。方法采用Realtime-PCR方法检测miR-130a在三对耐药细胞株及其亲本细胞株中的表达情况；通过网站筛选出miR-130a可能的靶基因,并用Realtime-PCR方法检测预测靶基因在三对耐药细胞株及其亲本细胞株中的表达情况；采用慢病毒感染下调耐药乳腺癌细胞株MCF7/Adr中miR-130a的表达。结果miR-130a在耐药乳腺癌细胞株MCF7/Adr和耐药小细胞肺癌细胞株H69AR中高表达,而在其亲本敏感细胞株MCF7和H69中低表达。通过网站筛选出miR-130a可能的靶基因为PTEN,且PTEN在MCF7/Adr和H69AR中低表达,而在MCF7和H69中高表达。慢病毒感染MCF7/Adr后72h可观察到绿色荧光,miR-130a表达水平下调。小结miR-130a在耐药细胞株高表达,在亲本细胞株低表达,而预测的靶基因PTEN表达趋势相反,慢病毒成功感染MCF7/Adr下调了miR-130a的表达。