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口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔恶性肿瘤的90%以上,是全球第六大最常见的恶性肿瘤。OSCC侵袭性高,多侵犯邻近的骨组织,进而转移到局部淋巴结,易出现局部复发,而且具有高度异质性生物学行为,导致不同患者表现出不同的侵袭性和预后。目前OSCC的主要治疗手段是手术、化疗、放疗或这些治疗方式的结合,尽管在联合治疗方面取得了显著进展,但OSCC患者的总体生存率仍很低。发现OSCC早期诊断肿瘤标志物对于患者的早期筛查及良好预后起着关键作用,靶向治疗可以更有效的针对OSCC,同时避免危害正常细胞。但目前仍然缺乏理想的、特异的OSCC相关基因靶点。本次实验旨在研究基因X及基因Z的可变剪接对OSCC细胞的生物学功能影响,为寻找OSCC生物标志物提供新的线索。目的:探索基因X及基因Z的可变剪接在口腔鳞癌发生、发展中的作用及对细胞生物学行为的影响,进一步探索口腔鳞癌发生的分子机制,从而为口腔鳞癌的早期诊断及靶向治疗提供新的线索和依据。方法:用携带含有外显子15的基因Z慢病毒载体,以及去除外显子15的基因Z慢病毒载体,感染人舌鳞癌细胞(CAL-27细胞),构建基因Z的可变剪接体稳定表达细胞系;对于前期研究已构建成功的基因X高表达稳定细胞系CAL-27-Gene X及其对照组细胞CAL-27-Ctrl,以及本研究构建的基因Z的不同可变剪接体稳定细胞系CAL-27-Z(15+)和CAL-27-Z(15-),利用实时无标记细胞功能分析仪测定各组细胞的生长速度,将各组细胞在x CELLigence RTCA MP E-plae96孔板中培养,实时细胞分析系统对各组细胞的生长情况检测96-112 h,然后进行对比分析;采用平板克隆形成实验测定细胞的克隆形成能力,在六孔板中培养各组细胞,孵箱培养3周后终止培养,固定,染色,拍照,最后计数统计;采用Transwell实验测定各组细胞的迁移及侵袭能力,检测侵袭能力之前在小室底铺2%的Matrigel I胶,将各组细胞加入小室置于孵箱,培养12-16 h收集细胞,根据穿过小室的细胞数量来检测细胞的迁移和侵袭能力,每个孔随机取9个视野,计数、统计;采用流式细胞技术检测各组细胞周期分布情况,收集状态良好的细胞,乙醇固定,4℃避光染色30min后用流式细胞仪进行检测,最后用Modfit软件进行分析;采用裸鼠皮下成瘤实验检测各组细胞在动物体内的的皮下成瘤能力,取4周龄、体重18-20g左右的SPF BALB/C裸鼠,在其右侧腹股沟中上部皮下注射4×10~6cell/只。每日观察拍照,并用游标卡尺测量裸鼠皮下形成瘤体的体积,1个月后取出瘤体,称重,测量,拍照,取一部分浸泡在福尔马林中固定包埋做病理检测,另一部分冷冻保存备用,并对结果进行统计分析。结果:1.实时无标记细胞功能分析结果显示,基因X的高表达稳定细胞CAL-27-Gene X在培养96 h时,生长速度是对照组细胞CAL-27-Ctrl的2倍;基因Z外显子15稳定表达细胞CAL-27-Z(15+)在培养112 h时,生长速度是基因Z未表达外显子15稳定细胞CAL-27-Z(15-)的2倍。2.平板克隆形成实验结果表明,基因X高表达稳定细胞CAL-27-Gene X在培养21天克隆形成数量是对照组细胞CAL-27-Ctrl的2倍,差异具有显著性(p=0.0037);基因Z外显子15稳定表达细胞CAL-27-Z(15+)在培养21天,克隆形成数量是基因Z未表达外显子15稳定细胞CAL-27-Z(15-)的2倍,差异具有统计学意义(p=0.0058)。3.Transwell实验结果表明,各组细胞培养12 h检测细胞迁移能力,基因X高表达稳定细胞CAL-27-Gene X,穿过小室的数量是对照组细胞CAL-27-Ctrl的25倍,差异具有显著性(p<0.0001);各组细胞培养16 h检测侵袭能力,CAL-27-Gene X细胞穿过小室的数量是CAL-27-Ctrl的21倍,差异具有非常显著性(p<0.0001);基因Z外显子15稳定表达细胞CAL-27-Z(15+)培养12 h,迁移的细胞数量是基因Z未表达外显子15稳定细胞CAL-27-Z(15-)的21倍,差异具有非常显著性(p<0.0001);培养16 h,侵袭的细胞数量是CAL-27-Z(15-)细胞的26倍,差异具有非常显著性(p<0.0001)。4.流式细胞检测技术结果表明,基因X高表达稳定细胞CAL-27-Gene X在S期和G2/M期的占比显著高于对照组细胞CAL-27-Ctrl,差异均具有显著性(p=0.0074;p=0.0154);基因Z外显子15稳定表达细胞CAL-27-Z(15+)在G2/M期的占比明显高于基因Z未表达外显子15稳定细胞CAL-27-Z(15-),差异有统计学意义(p=0.0289)。5.裸鼠皮下成瘤实验结果表明,各组细胞分批注射于裸鼠右侧腹股沟中上部皮下,1个月后基因X高表达稳定细胞CAL-27-Gene X在皮下形成瘤体的体积是对照组细胞CAL-27-Ctrl的3.2倍,形成瘤体的重量是CAL-27-Ctrl的2.8倍,差异均有显著性(p=0.038;p=0.0001);基因Z外显子15稳定表达细胞CAL-27-Z(15+)皮下形成瘤体的体积是基因Z未表达外显子15稳定细胞CAL-27-Z(15-)的3.3倍,形成瘤体的重量是CAL-27-Z(15-)的2.7倍,差异均具有显著性(p<0.0001)。HE染色显示肿瘤组织为高分化鳞状细胞癌。结论:本研究成功构建基因Z含有外显子15的剪接体稳定表达细胞系CAL-27-Z(15+),以及基因Z去除外显子15的剪接体稳定表达细胞系CAL-27-Z(15-),并且通过一系列体外和体内实验阐明基因X及基因Z的可变剪接在OSCC发生、发展中均发挥着重要作用。1.高表达基因X,OSCC细胞生长速度明显加快,迁移及侵袭能力、平板克隆形成能力、裸鼠皮下成瘤能力均明显增强,细胞周期S期及G2/M期占比升高,提示细胞增殖活跃。2.与基因Z未表达外显子15的细胞相比,基因Z的外显子15的表达可以使OSCC细胞的生长速度明显加快,迁移及侵袭能力、平板克隆形成能力、裸鼠皮下成瘤能力均明显增强,细胞周期G2/M期占比升高,提示细胞增殖活跃。