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研究背景和目的肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,每年约有70万的新发病例,其中半数发生在中国。肝癌的病因及发病机制复杂,导致肝癌的异质性极高,很难通过化疗或靶向药物治愈。因此,深入研究肝癌的调控机制,探索新的治疗策略非常重要。肝细胞核因子FOXA是一类在肝细胞中特异性高表达的转录因子,其成员包括FOXA1、FOXA2和FOXA3。Okumura等报道,FOXA1和FOXA2能在肝癌细胞中显著抑制乙肝病毒S蛋白的表达。Kaestner等发现FOXA1/2能抑制雌性小鼠HCC的发生,但却促进雄性小鼠HCC发生。最近的一项研究显示,FOXA3在肺癌中的高表达预示着病人的不良预后,但FOXA3在肝癌中的表达及与作用尚不清楚。综上所述,本课题拟检测FOXA3在肝癌中的表达,并分析FOXA3与肝癌患者预后的相关性,评估其作为肝癌预后判定标志物的可行性;再通过研究FOXA3在肝癌细胞分化中的作用,探明其在肝癌治疗中的价值;分析FOXA3的表达与肝癌细胞对索拉非尼反应性的关联,探明FOXA3在索拉非尼个体化用药中的指导价值。研究方法:1.分析FOXA3在肝癌中的表达,明确其与患者预后的关联(1)Realtime PCR、免疫组织化学染色(IHC)或蛋白印迹法(Western blot)检测FOXA3在癌旁组织、肝癌组织、肝癌转移灶或复发灶中的差异表达。(2)Kaplan-Meier分析肝癌中FOXA3的表达与病人预后的关系,利用COX回归进行独立预后危险因素分析。2.FOXA3在肝癌中表达下调的机制研究(1)利用si-RNA干扰肝癌细胞系HCCLM3和Huh7中m6A甲基化酶及去甲基化酶的表达后,以Realtime PCR检测FOXA3的表达。(2)Realtime PCR或IHC法检测FOXA3、METTL3、METTL14、WTAP及FTO在肝癌中的表达,分析FOXA3与其他分子表达的相关性。(3)利用m6A-RIP-q PCR实验明确FOXA3是否受到m6A甲基化的调控。3.FOXA3调控肝癌细胞分化的研究(1)Realtime PCR检测FOXA3在肝细胞分化过程中的表达;过表达或干扰FOXA3对肝癌细胞或正常肝细胞中肝细胞标志物表达的影响。(2)Realtime PCR、IHC法检测胎肝、成人肝与肝癌组织中FOXA3的表达,并分析FOXA3与病人肝癌分化程度的相关性。(3)肝癌细胞系感染Ad-FOXA3后,利用PAS染色、油红染色、尿素与白蛋白分泌检测等分析肝细胞功能改善情况,并行RNA-seq及生物信息学分析。(4)利用细胞成球实验、流式细胞术和体内外有限稀释实验,分析FOXA3对肝癌干细胞自我更新能力的影响。(5)利用流式细胞术和Ed U染色检测肝癌细胞系过表达FOXA3后增殖的变化。(6)将AAV-FOXA3瘤内注射HCC-PDX后,评价其体内治疗效果。4.FOXA3增敏索拉非尼的机制及临床相关研究(1)流式细胞术检测过表达FOXA3后索拉非尼诱导肝癌细胞系凋亡的变化。(2)利用Ch IP-PCR实验探明FOXA3对索拉非尼内流转运体OATP1B1与OATP1B3转录的调控。(3)LC-MS/MS检测肝癌细胞系转染si-OATP1B1与si-OATP1B3后索拉非尼摄取的变化。(4)IHC检测术后服用索拉非尼的肝癌患者FOXA3的表达,Kaplan-Meier评估FOXA3对索拉非尼个体化治疗的指导价值。(5)利用HCC-PDX模型分析FOXA3高/低表达与肝癌对索拉非尼治疗反应性的关联。研究结果:1.与癌旁组织相比,FOXA3在肝癌组织中表达显著降低,并在肝癌转移灶及复发灶中进一步降低。FOXA3低表达与患者不良预后相关,且是独立预后危险因素。2.在肝癌中FOXA3与METTL14的表达相关,且FOXA3在m RNA水平受METTL14介导的m6A甲基化所调控。3.FOXA3在肝细胞的分化过程中逐渐增加,且在胎肝与肝癌中的表达较成体肝相比显著降低。4.在肝癌细胞系中过表达FOXA3后,肝细胞相关功能如白蛋白分泌、尿素合成、及糖原合成等显著加强。5.RNA-seq结合生物信息学分析发现FOXA3可能通过上调一系列具有分化功能的分子调控肝癌细胞分化。6.过表达FOXA3能显著下调肝癌细胞系中肝癌干细胞的比例,并抑制肝癌干细胞的自我更新。7.过表达FOXA3能显著抑制体外肝癌细胞增殖,并且瘤内注射AAV-FOXA3可有效抑制肝癌生长。8.过表达FOXA3可增加索拉非尼诱导的肝癌细胞凋亡。9.Ch IP-PCR和LC-MS/MS的结果显示:FOXA3可促进索拉非尼内流转运体OATP1B1与OATP1B3转录,从而增加肝癌细胞对索拉非尼的摄取。10.Kaplan-Meier分析的结果显示,索拉非尼对FOXA3高表达的患者疗效更好。11.与FOXA3低表达的肝癌PDX相比,FOXA3高表达的PDX对索拉非尼的反应性更好。结论:FOXA3在肝癌组织中表达显著降低,并与患者预后相关;FOXA3在肝癌细胞中的表达受到METTL14介导的m6A甲基化调控;FOXA3高表达的肝癌分化状态更好,且FOXA3能促进肝癌细胞分化并能诱导肝癌干细胞分化;肝癌中FOXA3高表达的患者能从索拉非尼治疗中获益。这些结果为肝癌的分化治疗提供了新的思路,也为索拉非尼个体化治疗提供了潜在的标志物。