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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以滑膜炎为主要病理特征并伴进行性加重的关节结构毁损的自身免疫病。其病变特点为侵蚀性滑膜炎、滑膜增生及血管翳形成,以及由此造成的关节软骨和骨破坏,最终导致关节畸形和功能障碍。近来的研究日益证实滑膜细胞在RA的发生和发展过程中具有重要意义,是进一步研究RA病理生理机制及药物筛选的重要靶点。因此,建立滑膜细胞的体外培养模型是研究RA病理生理的基础。白介素(interleukin, IL)-23是一种新近发现的细胞因子,具有调控Th17细胞分化成熟的作用,参与了多种自身免疫性疾病的发病。外周血和滑液的IL-23表达水平与RA的活动度相关,且用抗IL-23抗体阻断IL-23后使滑膜细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达显著降低。核因子κB受体配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)是诱导破骨细胞分化和成熟的关键因子；RA滑膜成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是RANKL主要来源并且具有诱导破骨细胞分化的功能。因此,本研究主要是探讨IL-23P19是否直接作用于RA-FLS,通过何种机制促进RANKL的表达。第一部分成纤维样滑膜细胞体外培养模型的建立目的：建立成纤维样滑膜细胞(FLS)体外培养的模型。方法：收集行关节置换术的RA(n=13)患者的关节滑膜组织,采用组织块贴壁培养法进行原代体外培养,经细胞形态学、流式细胞术(FCM)、蛋白印迹法(Western Blot)鉴定FLS细胞表面标记的表达,建立FLS的体外培养模型。结果：原代培养的FLS呈现典型的梭形形态；FCM检测到CD90在FLS上表达达96.3%;Western Blot可以检测到CD90的表达条带。结论：组织块贴壁培养法可简便、有效地分离培养FLS。第二部分白介素(IL)-23p19对FLS核因子κB受体激活剂配体(RANKL)的作用目的：研究白介素(IL)-23p19刺激对类风湿关节炎患者FLS的核因子κB受体激活剂配体(RANKL)表达影响。方法：分别用不同浓度(1、5、20ng/m1)的IL-23p19刺激RA患者FLS24h,及用5ng/ml的IL-23p19刺激RA FLS不同的时间(0、1、4、8、12、24h),再以实时荧光定量聚合酶链反应(real time-PCR)法检测RA FLS RANKL mRNA水平,Western Blot(?)(?)检测5ng/ml的IL-23p19处理24h后RAFLS的RANKL蛋白水平的表达。用5ng/mlIL-23p19、1ng/mlIL-17A.2ng/mlIL-17F、5ng/mlIL-23p19联合1ng/mlIL-17A、5ng/mlIL-23p19联合2ng/m1IL-17F分别刺激FLS后real time-PCR检测RANKLmRNA的表达。用5ng/mlIL-23p19、1ng/mlIL-17A、2ng/mlIL-17F分别刺激FLS后real time-PCR检测IL-17R、IL-23R、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2mRNA的表达。然后再分别用信号通路抑制剂(Janex-1、AG-490、U-0126、PDTC、 Sp600125、Wortmannin)处理RA1h后再加入5ng/ml的IL-23p19刺激FLS24h后在mRNA水平检测IL-17R的表达。最后再分别用信号通路抑制剂(Janex-1、 AG-490、U-0126、PDTC、Sp600125、Wortmannin)处理RAFLS1h后再加入5ng/ml的IL-23p19,24h后在mRNA水平、蛋白水平检测RANKL的表达情况。结果：通过IL-23p19的刺激可显著增加RA FLS的RANKL的表达,以5ng/ml和刺激24h作用达到峰值。JNK通路抑制剂、P13K通路抑制剂在IL-23p19诱导的RANKL表达中有促进作用；JAK2通路抑制剂、JAK3通路抑制剂、NF-κB通路抑制剂、Erk通路抑制剂可以抑制IL-23p19诱导的RANKL表达。IL-23p19、IL-17A、IL-17F、IL-23p19联合IL-17A、IL-23p19联合IL-17F都可以促进RANKL、IL-17R mRNA的表达。IL-23p19对IL-17R的促进作用可能是通过NF-κB、Erk、JAK2通路完成。结论：IL-23p19可显著促进RA FLS RANKL的表达；这种促进作用可能是通过NF-κB、JAK2、JAK3、Erk等信号通路完成。IL-23p19、IL-17均可以促进RANKL、IL-17R的表达；IL-23p19、IL-17促进IL-17R的表达可能是通过NF-κB、Erk、JAK2等信号通路实现。总结1.组织块贴壁培养法可以成功的构建类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的体外培养模型。2.IL-23p19促进RA FLS RANKLmRNA和蛋白的表达。3.IL-23p19可能是通过NF-κB、JAK2、JAK3、Erk等通路促进RA FLS RANKL的表达。4.IL-23p19联合IL-17也可以促进RANKL、IL-17R的表达。5.IL-23p19促进IL-17R的表达可能是通过NF-κB、Erk、JAK2通路实现。