目的:乳腺癌是全球女性最常被诊断的恶性肿瘤,发病率呈持续增长的趋势,目前乳腺癌已超越肺癌成为全球第一大癌。尽管对于乳腺癌的早期诊断和治疗已经取得了实质性进展,然而那些已发生远处转移的乳腺癌患者通常是无法治愈的。且许多乳腺癌幸存者会因手术和放射治疗等遭受持久的身体损伤,并可能承受癌症复发或发展为第二原发性恶性肿瘤的风险,这使得这些患者的治疗仍然是需要继续研究的领域。肿瘤遗传学的进步改变了治疗乳腺癌的方式,识别靶向突变可能有助于选择哪些药物更有可能对特定的肿瘤类型有效,而一些信号通路方面研究取得的进展,更是促进了许多新药的开发和批准,改变了转移性乳腺癌患者的治疗前景。尽管肿瘤生物学研究的进步让我们在乳腺癌治疗方面取得了重大进展,然而由于肿瘤的复杂性,在真正的临床研究和实践中仍然面临着巨大的挑战,因此有必要增强对肿瘤生物学、致癌机制和驱动改变的了解,以增加识别可靠的预后和预测性生物标志物的能力。在哺乳动物中,Hippo信号通路激活的关键环节是通过激酶级联作用促进转录激活因子YAP（Yes-associated protein）及其旁系TAZ（WW domain–containing transcription regulator protein 1）的磷酸化,抑制其入核,进而限制组织生长和细胞增殖。其中关键调节因子是LATS1（Large tumor suppressor 1）和LATS2（Large tumor suppressor 2）激酶,LATS1/2在多个位点直接磷酸化YAP和TAZ,磷酸化的YAP/TAZ定位于胞浆,抑制其入核,进而被14-3-3蛋白通过泛素化蛋白酶体途径降解。而非磷酸化的YAP/TAZ可以入核,与DNA结合蛋白（包括TEAD家族中的蛋白）相互作用,从而触发促进细胞增殖和迁移的基因的重要转录程序。FBXL16（F-box and leucine-rich repeat protein 16）是F-box蛋白家族的成员之一,目前,FBXL16在恶性肿瘤中的作用还研究甚少,基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库结果显示,与正常乳腺组织相比,FBXL16在乳腺癌组织中高表达,且与FBXL16高表达者相比,FBXL16低表达组乳腺癌患者生存率升高。Genemania,Hitpredict等网站均预测FBXL16可能与LATS2之间存在蛋白质互作关系,且置信度较高,而LATS2激酶及其同源物LATS1是Hippo信号通路的关键调节因子,因此我们提出假说FBXL16能否通过与LATS1/2的相互作用,调控它们在乳腺癌细胞中的表达,进而调节Hippo信号通路活性,影响乳腺癌细胞的生物学行为,为乳腺癌的治疗提供新的靶点。研究方法:1.首先我们检索了GEPIA、Bio GRID、Kaplan-Meier、Genemania、Hitpredict及STRING等多个数据库,评估了FBXL16在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达差异、其与乳腺癌患者生存率的关系,以及一系列相互作用蛋白,为本研究提供理论基础。2.随机选取2014年1月至2016年12月中国医科大学附属第一医院病理科的40例女性乳腺浸润性导管癌标本和32例乳腺癌癌旁标本进行免疫组织化学染色,以探讨FBXL16在乳腺癌中的表达情况。患者年龄为28至81岁,对已有的随访资料如年龄、肿瘤大小、组织学分级、激素受体表达情况、淋巴结转移等进行相关性分析。对所有切片使用SP法进行免疫组织化学染色,随后根据染色强度和染色细胞范围进行半定量评分。根据预实验我们得知FBXL16在乳腺组织中定位于胞浆,因此我们对胞浆着色的切片进行后续评分。FBXL16染色强度为:0分（不表达）,1分（弱表达,淡黄色颗粒）,2分（中等强度表达,黄色颗粒）,3分（强表达,棕黄色颗粒）。染色范围为:0分（无染色）,1分（1-25%范围着色）,2分（26-50%范围着色）,3分（51-75%范围着色）,4分（76-100%范围着色）。将每张切片的得分相乘,得到0到12的最终得分,将得分大于3的切片认定是FBXL16阳性表达,得分小于3的切片认定为阴性。3.本实验使用的细胞系主要有正常乳腺导管上皮细胞MCF-10A,乳腺癌细胞系MCF-7（Luminal型）、SK-BR-3（Her-2过表达型）和MDA-MB-231（ER、PR、Her-2三阴型）,均购买于中科院上海细胞库。所有细胞培养均需在无菌条件下操作,MCF-10A细胞用含有5%马血清,20 ng/ml EGF和10μg/ml胰岛素的DMEM/F12（1:1）培养液培养。MCF-7和SK-BR-3用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养。MDA-MB-231用含10%胎牛血清的L15培养液培养。所有细胞均置于37℃,5%CO2的孵箱中进行孵育,每1-2天更换新鲜培养液。4.为了检测FBXL16在不同细胞系中的表达情况及YAP的核浆定位情况,我们进行了免疫荧光实验,将不同细胞接种在已放入细胞爬片的24孔板中,37℃、5%CO2的孵箱中孵育18-24小时,取出24孔板,4%多聚甲醛固定20分钟,0.2%的Triton X-100打孔15分钟,3%的BSA或山羊正常血清室温下封闭1小时,加入特异性一抗（FBXL16 1:100稀释,YAP 1:100稀释）,4℃冰箱内孵育过夜。18小时后,吸除一抗,在避光条件下加入荧光二抗（稀释1:100）,室温避光条件下孵育2小时,最后用DAPI进行细胞核染色10分钟,荧光显微镜下观察FBXL16及YAP的表达及定位情况,并进行图像采集。5.本实验使用的转染试剂为Attractene转染试剂,待细胞密度达到70%左右时进行转染,对于2ml体系的培养皿或六孔板,将1.2μg质粒（PCMV6、Myc-DDK-FBXL16、LATS1、LATS2、HA-Ubiquitin）和4.5μl Attractene转染试剂加入100μl无血清培养液或MEM培养液中,室温静置15分钟后加入更换新鲜培养液的贴壁细胞中,轻摇混匀,置于37℃、5%CO2的孵箱中孵育。本实验干扰试剂使用Lipofectamine 3000,待细胞密度达到50%左右时进行干扰,对于2ml体系,将7.5μl的lipo置于250μl无血清培养液或MEM培养液中,静置5分钟为A液。将7.5μl NC-siRNA或FBXL16/LATS1/LATS2-siRNA干扰序列置于250μl无血清培养液或MEM培养液中,为B液,二者混合摇匀后室温静置15分钟加入更换新鲜培养液的细胞中,轻摇混匀,置于37℃、5%CO2的孵箱中孵育。6.细胞蛋白提取实验,转染或干扰48h后,收取细胞沉淀。总蛋白提取加入NP40细胞裂解液（该裂解液中已提前加入蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂,比例为100:1:1）,冰上裂解30分钟,使用低温（4℃）高速离心机以12000rpm的速率离心20分钟,所得上清即为总蛋白。在每20μl细胞沉淀物中加入200μl添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A,涡旋5秒,使细胞沉淀分散,冰浴10分钟,加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10μl,涡旋5秒,冰浴1分钟,涡旋5秒,低温（4℃）高速离心机以12000rpm的速率离心5分钟,所得上清即为浆蛋白。将上述沉淀用滤纸完全吸尽残余上清,加入50μl添加了PMSF的细胞核蛋白提取试剂,涡旋至细胞沉淀完全分散开,放入冰浴中,每隔1-2分钟涡旋15-30秒,共30分钟,低温（4℃）高速离心机以12000rpm的速率离心10分钟,所得上清即为核蛋白。7.为了明确FBXL16与LATS1、LATS2的相互作用关系以及FBXL16对LATS1、LATS2泛素化水平的影响,我们进行了免疫共沉淀实验,收取总蛋白,每组蛋白裂解液中加入20μl混匀的Protein A+G磁珠,4℃旋转摇床上孵育2小时封闭处理,吸取上清。每1mg蛋白中加入1μg特异性一抗或相同属性的Ig G抗体,4℃旋转摇床上孵育过夜。18-24小时后加入Protein A+G磁珠,4℃旋转摇床上孵育4-6小时,低温（4℃）离心机以1000rpm速率离心10分钟,弃除上清,用NP40裂解液将沉淀清洗三次,所得免疫复合物中加入相同体积的2×SDS loading缓冲液使其终浓度为1×,沸水煮10分钟使蛋白充分变性,进行Western blot检测。8.Western blot检测蛋白表达情况,将总蛋白或细胞浆蛋白、细胞核蛋白用紫外分光光度计或Bradford法测取蛋白浓度,将等量蛋白与6×SDS loading缓冲液混合,使其终浓度为1×,沸水中煮5分钟使蛋白充分变性。按照每份15μl的体积将等量蛋白样本加入到8%或10%的凝胶中,通过SDS-PAGE电泳分离出不同分子量的蛋白,然后用湿式转印法将蛋白转印到PVDF膜上,洗膜液清洗后,将PVDF膜加入到5%的脱脂牛奶中,室温摇床中封闭2小时,随后将相应分子量的PVDF膜置入特异性一抗中4℃冰箱孵育过夜。18-24小时后,取出PVDF膜,随后用HRP标记的相应二抗室温摇床孵育2小时,随后进行ECL法发光,并采集图像,应用Image J软件检测蛋白条带的灰度值。9.用G418对瞬时转染FBXL16的MCF-7细胞系进行稳转筛选,细胞接种于24孔板培养16-18小时,加入不同浓度梯度的G418（1～1100μg/ml）,每两天换液,培养10天,观察细胞刚好全部死亡的浓度,以确定筛选浓度（400μg/ml）和维持浓度（200μg/ml）。细胞接种于24孔板,并进行转染,48小时后加入筛选浓度的G418,每2-3天更换含有筛选浓度G418的培养液,当细胞大量死亡,存活细胞长出单克隆集落,挑出集落移至无菌培养皿中继续培养。经过28天左右的筛选,Western blot测转染效率,得到稳定表达FBXL16的MCF-7细胞系。10.为了验证FBXL16的体内生物学功能,设计了裸鼠体内成瘤实验。培养稳定转染FBXL16的MCF-7细胞,在其处于对数生长期时收集细胞,配制细胞数为5×10~7/ml的细胞悬液。在随机分为2组的4～5周龄的BALB/c Nude裸鼠腋下分别注射200μl未做处理的MCF-7细胞和稳定转染FBXL16的MCF-7细胞,无菌饲养25天,分别于0、5、10、15、20、25天测量并记录肿瘤大小。颈椎脱臼法分组处死裸鼠,拍照、收取肿瘤、测量瘤体大小及重量。11.MTT实验检测细胞增殖活力,将含有3000个细胞的100μl细胞悬液加入到96孔板中,连续培养5天,每天固定时间将原培养液置换为含有10μl MTT的无血清培养液,避光处理,37℃、5%CO2孵箱中孵育4小时。随后弃掉培养液,加入150μl DMSO将MTT溶出,室温摇床上孵育10分钟,使用酶标仪检测490nm波长吸光度值,并绘制折线图。克隆形成实验检测细胞集落形成能力,每个处理组计数1000个细胞加入到含有2ml培养液的六孔板或培养皿中,每3-4天更换新鲜培养液,37℃、5%CO2孵箱中培养10天左右。弃掉培养基,预冷甲醇固定15min,苏木素染色10分钟,自来水返蓝20分钟。采集图像,计数集落。12.Transwell细胞迁移实验检测细胞的迁移能力,用含有2%血清的培养液将相应处理的细胞制备成细胞悬液,计数细胞,制备成200ul细胞悬液加入上室。下室中加入含有20%血清的新鲜培养液,37℃、5%CO2孵箱中孵育16-18小时。预冷甲醇固定15分钟,苏木素染色15分钟,1%盐酸酒精分化2次,自来水返蓝10分钟。用显微镜计数细胞,采集图像。13.通过Pearson卡方检验分析FBXL16表达的临床病理相关性。实验组与对照组之间或各实验组之间的差异采用配对t检验进行分析。P＜0.05时认为差异存在统计学意义,所有实验至少重复3次。结果:1.GEPIA数据库结果显示,与正常乳腺组织相比,FBXL16在乳腺癌组织中高表达,且与FBXL16高表达者相比,FBXL16低表达组乳腺癌患者生存率升高。免疫组织化学染色结果显示在正常乳腺导管上皮中FBXL16呈低表达或不表达,乳腺癌组织中FBXL16表达明显升高,且主要定位于细胞浆。临床病理分析结果显示该40例乳腺癌组织中FBXL16表达与肿瘤的组织学分级呈正相关,结果具有统计学意义（P＜0.05）。细胞系免疫荧光结果显示无论在正常乳腺上皮MCF-10A还是不同乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-231中,FBXL16均主要定位于细胞浆。细胞系Western blot实验结果显示,FBXL16在三种乳腺癌细胞系中的表达均高于正常乳腺导管上皮细胞中的表达。2.为了验证FBXL16在乳腺癌细胞中的生物学功能,在MCF-7细胞和SK-BR-3细胞中分别转染和干扰FBXL16以双向调控FBXL16的表达,MTT和克隆形成实验结果显示转染FBXL16后细胞增殖能力增强,干扰FBXL16后细胞增殖能力减弱。Transwell实验结果显示转染FBXL16后细胞迁移能力增强,干扰FBXL16后细胞迁移能力减弱。3.为了验证FBXL16的体内生物学功能,进行了裸鼠体内成瘤实验,向裸鼠皮下注射未做处理的MCF-7细胞及稳定转染FBXL16的MCF-7细胞,结果显示过表达FBXL16能够显著促进裸鼠体内成瘤。4.Genemania,Hitpredict等多个网站均预测FBXL16可能与LATS2之间存在蛋白质互作关系,而LATS2激酶及其同源物LATS1是Hippo信号通路的关键调节因子,因此我们双向调控FBXL16后检测了LATS2、LATS1以及Hippo信号通路的关键蛋白及下游靶基因的蛋白表达水平,YAP的核浆定位情况,结果显示FBXL16能够抑制Hippo信号通路的激活。5.为了明确FBXL16与LATS2、LATS1之间的相互作用关系,在MCF-7及SK-BR-3细胞系中进行了免疫共沉淀实验,结果显示FBXL16能够与LATS2和LATS1相互结合。之前的实验中已经证实FBXL16能够下调LATS2和LATS1的蛋白表达,因此在MCF-7细胞中转染FBXL16后,检测了LATS2、LATS1的泛素化水平和蛋白稳定性,结果显示FBXL16能够通过促进LATS2和LATS1的泛素化蛋白酶体降解途径下调其表达。6.为了明确FBXL16对Hippo信号通路以及乳腺癌细胞生物学行为的调控是否依赖LATS1、LATS2,进行了回复实验,在MCF-7细胞中干扰FBXL16的同时下调LATS1、LATS2的表达,Western blot检测Hippo信号通路关键蛋白,并进行功能学实验,结果显示,FBXL16对Hippo信号通路的调控作用是依赖LATS1、LATS2激酶实现的,并能够通过LATS1/2调控乳腺癌细胞的生物学行为。结论:1.在乳腺癌组织及细胞系中FBXL16表达增高,且具有临床病理相关性。2.FBXL16在体内和体外均能促进乳腺癌细胞的生物学行为。3.FBXL16能够抑制Hippo信号通路的激活。4.FBXL16能够与LATS1/2结合,并通过促进LATS1/2的泛素化蛋白酶体降解途径下调其蛋白表达。5.FBXL16通过LATS1/2调控Hippo信号通路,进而调控乳腺癌细胞的生物学行为。