论文部分内容阅读
近年来,人们物质需求不断增长,我国畜禽饲养数量相应增加,耕地面积却在逐渐下降。随着畜禽饲料用粮的增加,“人畜争粮”矛盾日益严重。与此同时,我国大量作物秸秆资源被浪费的现象。我国牦牛由于生活环境恶劣,具有极强的耐粗饲能力,其瘤胃厌氧真菌拥有极强的纤维素降解能力。若能将牦牛瘤胃厌氧真菌添加至反刍动物瘤胃中,可能会极大地提升瘤胃微生物对纤维素的降解能力。从而增加作物秸秆等非粮型饲料在反刍动物日粮的用量,则可达到节约粮食,减少秸秆资源浪费,同时降低养殖成本的目的。本试验首先探究了牦牛瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.YF3对瘤胃发酵小麦秸秆起积极作用的最适添加剂量,之后探究驱除真菌及添加牦牛瘤胃厌氧真菌对瘤胃发酵及微生物区系的影响。为牦牛瘤胃厌氧真菌的开发应用,及增加作物秸秆等非粮型饲料在反刍动物日粮的用量等提供科学依据。本试验共包括两部分:试验一牦牛瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.YF3对体外发酵的影响本试验利用厌氧发酵瓶进行体外发酵,以1%（w/v）的粉碎风干小麦秸秆为发酵底物,向发酵体系中添加4种剂量的实验室前期分离纯化的牦牛瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.YF3菌液。旨在确定Orpinomyces sp.YF3发酵麦秸的最适添加剂量。本试验采用单因素试验设计。设置Orpinomyces sp.YF3菌液4个添加剂量:0%、5%、10%、15%,共4个处理3个发酵时间（1 d、3 d、5 d）,每个发酵时间每处理4重复。发酵结束后进行采样,测定麦秸体外干物质消失率、发酵液氨态氮、VFA、木聚糖酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、乙酰酯酶等4种酶活性。结果显示:1)添加Orpinomyces sp.YF3对麦秸体外干物质消失率没有显著影响;2)添加15%的Orpinomyces sp.YF3在发酵3 d后降低了发酵液氨态氮浓度（P<0.05）;3)添加Orpinomyces sp.YF3（10%、15%添加剂量）在发酵3 d和发酵5 d后提高了发酵液木聚糖酶和乙酰酯酶活性（P<0.05）;4)添加Orpinomyces sp.YF3提高了发酵液乙酸比例、乙丙比（P<0.05）,降低了异丁酸、丁酸、异戊酸比例（P<0.05）。本试验结果表明,添加牦牛瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.YF3菌液可促进纤维素的降解,且最适添加剂量为15%。试验二驱除真菌及添加牦牛瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.YF3对体外发酵及微生物区系的影响在试验1基础上,利用体外发酵探究驱除真菌及添加牦牛瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.YF3菌液对瘤胃发酵及微生物区系的影响。试验共分为对照组（C）、牦牛真菌组（CF）、驱除真菌组（CA）、驱除真菌+牦牛真菌组（CAF）4个处理,每处理6个重复。本试验采用2*2双因素试验设计。试验期11 d,d0,CA、CAF两组的发酵瓶添加放线菌酮（0.25 mg/mL）,39℃静置发酵2 d以除去发酵体系真菌。d2-d8,每天抽取所有瓶子的发酵液（50%）转移到新的装有人工唾液（50%）以及麦秸的厌氧发酵瓶,以除去放线菌酮对后续添加的Orpinomyces sp.YF3的影响。d4-d8,CF、CAF两组每天添加15%的Orpinomyces sp.YF3菌液,d11采样测定发酵液pH、氨态氮浓度、植物细胞壁降解酶活性、挥发性脂肪酸（VFA）、细菌多样性,以及C、CF两组的真菌多样性。试验结果表明:1)添加Orpinomyces sp.YF3提高了氨态氮浓度（P<0.001）,对pH没有显著影响;2)添加Orpinomyces sp.YF3提高了发酵液羧甲基纤维素酶（P<0.05）、微晶纤维素酶活性（P=0.001）。驱除真菌提高了微晶纤维素酶活性（P<0.001）;3)添加Orpinomyces sp.YF3提高了总VFA浓度和乙酸、异丁酸、戊酸比例以及乙丙比（P<0.001）,降低了丙酸、丁酸比例（P<0.001）。驱除真菌显著提高了乙酸比例、乙丙比（P<0.05）,降低了总VFA浓度、丙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸比例（P<0.05）。添加Orpinomyces sp.YF3显著提高了发酵液细菌多样性、丰富度以及均匀度（chao、shannon以及shannonven指数）。显著提高了发酵液中拟杆菌门、互养菌门、脱硫杆菌门、放线菌门、梭杆菌门的相对丰度,降低了纤维杆菌门和变形菌门的相对丰度（P<0.05）。提高了Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group、unclassified＿f＿＿Rikenellaceae、Ruminococcus、NK4A214＿group、Pyramidobacter、Anaerovorax（P<0.001）及norank＿f＿＿F082、norank＿f＿＿UCG-010、norank＿f＿＿Bacteroidales＿BS11＿gut＿group、Papillibacter、Schwartzia（P<0.05）的相对丰度,显著降低了Fibrobacter、Succinivibrio、Lachnospiraceae＿UCG-009（P<0.001）、Prevotella、unclassified＿f＿＿Lachnospiraceae、unclassified＿c＿＿Clostridia、probable＿genus＿10、norank＿f＿＿Bacteroidales＿UCG-001（P<0.05）的相对丰度。分析C、CF两组真菌多样性,结果发现发酵液中存在较多酵母菌。添加Orpinomyces sp.YF3对发酵液真菌α多样性以及门水平群落组成没有显著影响。在属水平,显著降低了四种酵母菌（Vishniacozyma、Sporidiobolus、Filobasidium、Alternaria、Bulleromyces）的相对丰度。驱除真菌对发酵液细菌α多样性没有显著影响。提高了发酵液细菌互养菌门、脱硫杆菌门的相对丰度（P<0.05）,降低了梭杆菌门的相对丰度（P<0.001）。在属水平提高了norank＿f＿＿F082、Christensenellaceae＿R-7＿group（P<0.001）、Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group、norank＿f＿＿Bacteroidales＿BS11＿gut＿group、Anaerovorax、Pyramidobacter的相对丰度,（P<0.05）,降低了Fusobacterium（P<0.001）、Prevotella、Streptococcus、norank＿f＿＿Bacteroidales＿UCG-001、Eubacterium＿ruminantium＿group（P<0.05）的相对丰度。将微生物与植物细胞壁降解酶活性及VFA进行相关性分析,结果发现,添加Orpinomyces sp.YF3与驱除瘤胃真菌导致的相对丰度升高的细菌大部分与羧甲基纤维素酶活、微晶纤维素酶活、总VFA浓度、乙酸比例正相关,降低的细菌多与丙酸比例正相关。将细菌与差异显著真菌进行相关性分析发现,大部分差异真菌与Prevotella、Fibrobacter、probable＿genus＿10显著正相关,与Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group、unclassified＿f＿＿Rikenellaceae、norank＿f＿＿F082、Ruminococcus、NK4A214＿group、norank＿f＿＿Bacteroidales＿BS11＿gut＿group、Schwartzia、Anaerovorax、Pyramidobacter等显著负相关。本试验表明,添加牦牛瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.YF3培养液可提高纤维降解相关细菌（例如Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group、Ruminococcus、NK4A214＿group、Pyramidobacter）及产乙酸相关细菌（Anaerovorax）,降低产丙酸相关细菌（Succinivibrio、Fibrobacter、Prevotella）的相对丰度,提高植物细胞壁降解酶活性,促进纤维素的降解,提高总VFA浓度,乙酸比例有利于提高反刍动物粗饲料利用率。