研究目的肝癌是一种致死率极高的恶性肿瘤疾病,我国每年约有40万新发病例,有超过34万例肝癌患者死亡,占全球总发病人数和总死亡人数50%以上。我国肝癌患者确诊时大多处于中晚期,多数伴有门静脉癌栓(Portal vein tumor thrombosis,PVTT),预后较差。PVTT是影响肝癌患者预后的重要风险因素。研究报道伴有PVTT患者的总体生存期较无PVTT的患者明显缩短,五年生存率不足20%。目前肝癌合并PVTT的治疗除手术介入治疗外,尚无其他显著有效的治疗手段。肝癌异质性较强,肿瘤组织成分复杂,PVTT发生机制及克隆起源不明是疗效不佳的原因之一。有研究报道PVTT的发生与肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)和肿瘤微环境密切相关。我们的早期研究发现ICR和miR135a等非编码RNA可以与其靶基因结合促进肿瘤细胞发生转移,增强肝癌肿瘤干细胞自我更新能力,促进PVTT的发生。14-3-3-ζ等蛋白通过缺氧肿瘤微环境抑制HIF-1α降解,增强肿瘤组织中上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),促进PVTT的发生,提示肝癌细胞转移能够诱导PVTT的发生。然而研究过程中,我们发现有一些小肝癌患者或者未见肝内原发灶的患者也有PVTT的发生,这些PVTT的来源与发生机制尚不清楚。本研究的主要目的:1)揭示不同起源PVTT与其对应原发灶肝癌组织的克隆起源差异;2)阐明不同起源的PVTT独特的分子表达特征;3)寻找鉴别PVTT-原发灶克隆起源相似性差异的判别基因集,为PVTT特异性治疗方法的研究提供一定的帮助。研究方法针对本课题的研究目的采用以下研究方法:1.采用DNA拷贝数变异(Copy number variations,CNV)芯片(Affymetrix CytoscanHD)检测肝癌患者来源PVTT及肝癌组织拷贝数变异情况。利用R语言affy2sv包,采用GISTIC(GISTC2.0)的算法在染色体水平分析同一患者来源PVTT和肝癌组织染色体结构异常是否一致。并在基因水平上,分析肿瘤发生相关基因突变及其表达情况对组织起源进行进一步确认。另外,根据组织基因表达谱,对PVTT及对应的肝癌组织进行分子分型分析,确认PVTT及肝癌组织所属的组织亚型。2.利用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,采用EBSeq进行差异表达分析检测不同起源的PVTT及对应肝癌组织特异表达谱,并进一步采用GO和KEGG pathway富集分析方法检测PVTT及肝癌组织的特异的生物学过程和信号通路,探讨不同起源PVTT发生的特征性分子表达谱。3.利用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,采用ssGSEA分析方法分析肝组织中胆管细胞、成熟肝细胞、肝前体细胞及肝星状细胞标记基因集在PVTT及肝癌组织的富集程度,探讨PVTT潜在的起源细胞类型。并采用相同的方法分析造血干细胞及肝癌干细胞相关基因集在PVTT及肝癌组织中的富集程度,探讨造血干细胞及肝癌干细胞在门静脉癌栓发生中的作用。4.利用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,在基因差异表达分析的基础上,构建基因互作网络并寻找核心位置的基因集。采用qPCR和聚类分析方法检测核心基因集在判断PVTT起源方面的应用潜能,探索性地寻找能够诊断PVTT的基因集。5.用PVTT及对应肝癌组织的表达谱测序(RNA-seq)数据,采用ssGSEA方法分析免疫细胞相关基因集在各PVTT及肝癌组织中的富集程度,检测PVTT中免疫细胞侵润情况。并进一步采用Nearest Template Prediction(NTP)方法分析PVTT及肝癌组织所属的免疫反应亚型,探讨免疫疗法在治疗肝癌PVTT中的应用潜能。研究结果CNV相似性分析发现19例患者中,18例患者来源PVTT和对应肝癌组织的相似性比值(likelihood ratio 2,LR2)较大(>10~9,P<0.05),剩余1例患者(患者编号13,P13)来源PVTT(PVTT13)和对应肝癌组织(T13)的LR2值非常小(LR2=0.0051,P>0.05)。染色体水平分析发现,PVTT13与T13之间存在明显不一致的染色体结构异常。在PVTT13中发生缺失的区段如2q24.1-2q31.1在T13中则发生扩增,在PVTT13中发生扩增的区段如5q13.2-5q35.2及15q11.2-15q21.1在T13中则发生缺失。在除P13患者之外的其余18例患者中则没有这种现象。CNV基因水平分析发现,10个肝癌相关驱动基因的突变情况在PVTT13与T13之间也存在较大差异。如ADCY2在PVTT13中拷贝数(Copy Number=5)明显高于T13中的拷贝数(Copy Number=2);CTNNB1在PVTT13中拷贝数(Copy Number=3)明显高低于T13中拷贝数(Copy Number=5)。P13患者来源两种组织之间同一基因拷贝数差异为2,而在其余13例患者中同一基因拷贝数差异为1.另有5例患者其PVTT和肝癌组织之间不存在基因拷贝数差异。肝癌分子分型分析发现,PVTT13与T13属于不同的肝癌亚型,其中PVTT13属于高分化的S3型,T13属于中低分化的S1型。在差异基因表达谱分析中,PVTT13与T13之间有超过2000条基因表达差异超过3倍,对这些差异表达基因进行GO富集分析和KEGG pathway分析发现,PVTT13中异常表达的基因主要涉及介导免疫应答的白细胞活化、细胞因子合成等过程以及NK细胞介导的细胞毒性通路及NF-κB信号通路等;T13中异常表达的基因主要涉及细胞周期检查点、DNA复制等过程及p53信号通路及PPAR信号通路等。PVTT潜在起源细胞类型分析发现,胆管细胞基因集、成熟肝细胞基因集、肝前体细胞基因集和肝星状细胞基因集在PVTT13和T13中都有富集,其中成熟肝细胞基因集富集分数较高。肝星状细胞基因集在T13中富集分数较高。另外,造血干细胞和肿瘤干细胞标记基因集ssGSEA富集分析发现,造血干细胞基因集在PVTT13中富集分数为3114,在T13中的富集分数为1031,肝癌肿瘤干细胞基因集在PVTT13中富集分数为705,在T13中富集分数为-1385,而EpCAM阳性肝癌肿瘤干细胞基因集在PVTT13中富集分数为-315,在T13中富集分数为1401。在探索性寻找PVTT-原发灶克隆起源相似性判别基因集的过程中,结合CNV芯片及RNA-seq表达谱差异分析发现有160个基因在PVTT13和T13中存在一致性差异表达。基因互作网络分析发现24个基因处于核心位置。利用这24个基因表达数据对19例患者来源的PVTT和肝癌组织进行聚类分析,发现PVTT13和T13分属于不同的类别。将这24个基因定义为PVTT-原发灶克隆起源相似性判别基因集(PVTT origin Discriminant gene signature,PVTT-OD-24GS)。另外,GEO数据库下载其他肝癌患者门静脉癌栓及肝癌表达数据(GSE69164和GSE74656),利用PVTT-OD-24GS表达量对相应的标本进行聚类分析。结果显示,在GSE69164所包含的11对PVTT和肝癌组织中,9号患者来源的PVTT和肝癌组织分属不同的两类;在GSE74656所包含的5对PVTT和肝癌组织中,所有来源于同一患者的PVTT和肝癌组织都属于同一类别。另外,收集8例肝癌患者的PVTT和肝癌组织,采用定量PCR方法检测PVTT-OD-24GS中基因的表达情况及CNV水平。根据24个基因mRNA表达水平进行聚类分析发现有1例患者(2号)来源的PVTT和肝癌组织分属于不同的分组,其他7例患者来源的PVTT都同对应的肝癌组织在一个分组内。CNV分析发现该患者(2号)来源的两种类型组织中该24个基因的CNV水平差异较大。在免疫细胞浸润分析中,ssGSEA分析发现免疫细胞基因集在14例肿瘤样本中有较高的富集分数,其中有4例为PVTT,10例为肝癌组织。NTP进行组织免疫反应亚型分析发现,包括2例PVTT和6例肝癌的8例组织属于免疫反应亚型(Immune class),1例肝癌组织属于免疫衰竭亚型(Rest),其余样本无法判定类别(FDR>0.05)结论根据发生起源不同,PVTT分为两种类型,一种起源于相对应的原发灶肝癌组织,称为非独立起源PVTT(HCC dependent PVTT);另一个同相对应的原发灶肝癌组织具有不同起源,称为独立起源PVTT(HCC independent PVTT)。独立起源PVTT占所有PVTT比例较低。独立起源PVTT相较于其对应的原发灶肝癌组织有着独特的分子表达特征。非独立起源PVTT则具有与其原发灶肝癌组织相似的分子表达谱。基于独立起源PVTT特异性分子表达谱,通过多组学分析得到一个由24个基因组成的PVTT-原发灶克隆起源相似性判别基因集用以鉴别PVTT与其对应的原发灶肝癌组织是否具有相同的克隆起源。另外,癌栓中有可能有免疫细胞浸润,进而对免疫细胞治疗有较好的反应。免疫疗法可以作为肝癌PVTT治疗中的辅助治疗手段。