Dec1（human differentially expressed in chondrocytes）也被称为Stra13（stimulatedwith retinoic acid），BHLBH2(basic helix-loop-helix binding protein2)或Sharp2（splitand hairy related protein）是由Shen等在对哺乳动物分化系统的研究中从人类软骨细胞中分离得到的一个bHLH转录因子家族成员。该转录因子在细胞分化、凋亡、免疫调节、脂质代谢、甚至昼夜节律中均发挥重要作用。近期，越来越多的研究表明Dec1在一系列的肿瘤中均存在高表达，并且与肿瘤发生发展关系密切。例如，Dec1的表达在正常乳腺向原位及浸润型癌的发展过程中显著增加，并且与乳腺癌恶性级别呈正相关。Zheng等发现Dec1的表达在高分化向中度分化和低分化胃癌组织恶性进展的过程中显著上调。另外，与相邻正常组织相比，Stra13基因在结肠癌中大量表达。肾癌中，Stra13可以作为pVHL的靶点，由pVHL介导的表达下调说明其在肾癌肿瘤发生中的重要作用。在非小细胞肺癌中，Dec1的过表达与HIF-1α及碳酸酐酶-9密切相关。所有证据均表明Dec1在肿瘤恶性进展中的重要作用。然而在人脑胶质瘤中，Dec1的表达情况或其预后与治疗意义却未见明确报道。本研究中，我们主要通过免疫组化的方法检测人脑胶质瘤样本Dec1的表达情况，并且进一步分析Dec1的表达与患者临床病理资料、预后、替莫唑胺化疗反应性和替莫唑胺诱导的肿瘤细胞凋亡之间的相关性。另外，我们成功的构建了Dec1慢病毒表达载体及稳定表达Dec1的U251和U87胶质瘤细胞株，并在体内明确了Dec1过表达对胶质瘤替莫唑胺化疗反应性的影响。1. Dec1在人脑胶质瘤中的表达及其对替莫唑胺化疗敏感性的影响目的：Dec1是调控细胞分化和凋亡抑制的关键基因，在人类许多肿瘤中均存在高表达并且与肿瘤的恶性进展关系紧密。由于分化不良和低程度凋亡与肿瘤患者的预后不良和放/化疗耐受密切相关，我们对Dec1表达的预后价值进行评估，并且进一步分析其表达情况对胶质细胞瘤患者替莫唑胺化疗反应性的影响。方法：通过免疫组化的方法，在157例新诊断的原发性胶质细胞瘤和在替莫唑胺化疗期间复发的63例复发性胶质母细胞瘤患者中，对Dec1的表达情况进行检测。在新诊断的原发性胶质细胞瘤中，分析Dec1表达情况与患者的临床病理资料、预后和替莫唑胺化疗敏感性之间的相关性。在复发性胶质母细胞瘤患者中，通过TdT介导dUTP缺口末端标记法分析Dec1的表达情况与凋亡指数之间的相关性。结果：Dec1高表达与肿瘤高水平的病理级别和替莫唑胺化疗较差的反应性显著相关，并且可以作为一项独立的危险因素提示新诊断的原发性胶质细胞瘤患者的预后不良。在复发性胶质母细胞瘤患者中，Dec1的表达与凋亡指数呈负相关。结论：在胶质细胞瘤患者中，Dec1无论是作为临床预后因子或是对替莫唑胺化疗反应性的预测因子，都具有非常重要的价值。2.基于GatewayTM系统Dec1慢病毒表达载体的构建目的：利用GatewayTM技术构建Dec1基因的慢病毒表达载体并建立稳定表达该目的基因的人脑胶质瘤U251和U87细胞株。方法：从人脑胶质瘤组织中提取总RNA，经反转录得到目的cDNA。设计含有特异性酶切位点的引物，通过PCR扩增，获得用于重组的Dec1目的基因全长。将目的片段克隆至入门载体pENTRTM3C中产生入门克隆。利用GatewayTM技术，将入门克隆中的目的片段转接于目的载体Plenti6.3中产生表达克隆pLenti6.3-Dec1。在293T细胞中包装慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1并转染U251和U87细胞，通过Blasticidin筛选、Western blot鉴定，得到稳定表达Dec1的U251和U87细胞株。结果：目的基因Dec1全长的获取与慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1的构建经PCR和测序得到证实。用pLenti6.3-Dec1转染U251和U87细胞后，通过Blasticidin筛选，获得稳定表达Dec1的U251和U87细胞株。结论：成功构建了pLenti6.3-Dec1慢病毒表达载体并建立稳定表达Dec1的人脑胶质瘤U251和U87细胞株，为深入研究Dec1分子机制奠定基础。3. Dec1过表达在体内对胶质细胞瘤替莫唑胺化疗敏感性的影响目的：建立U87-cherry（对照）和U87-Dec1胶质瘤细胞的裸鼠成瘤模型。经替莫唑胺处理后，观察Dec1过表达对移植瘤替莫唑胺化疗敏感性的影响。方法：将1×106个U87-cherry和U87-Dec1肿瘤细胞分别皮下注射至每只裸鼠腹侧形成移植瘤。接种5-7天形成可触及的肿瘤后，连续5天在裸鼠饮食中添加50mg/kg的替莫唑胺。按照以下公式记录肿瘤体积：体积=a×b2/2（a=最长径，b=最短径）。取出皮下肿瘤进行称重后，制备病理切片标本，通过增殖标记Ki-67的免疫染色及TdT介导dUTP缺口末端标记法分别检测移植瘤的增殖和凋亡情况。结果：经过替莫唑胺处理30天后，U87-Dec1组移植瘤的平均重量和体积(114±12.99mg，1257±382.7mm~3）显著高于U87-cherry组（44±2.63mg，468.8±193.4mm~3，两者P＜0.001）。增殖及凋亡检测结果表明，U87-Dec1组移植瘤肿瘤细胞的增殖指数（51.6±3.74%）显著高于U87-cherry组（38.20±3.55%, t=2.600, P=0.032）；而U87-Dec1组的凋亡指数（15.26±2.20%）则显著低于U87-cherry组（44.10±2.69%，t=8.296, P＜0.0001）。结论：在体内，Dec1的过表达能够显著地抑制替莫唑胺的抗胶质瘤效应。