鲍消化道及养殖环境中异养菌的耐药性调查与耐药机制初步研究

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细菌性病原在鲍病害中占据主导地位,而细菌性病原以弧菌为主,报道的鲍相关病原菌主要有:溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、亮弧菌、哈维弧菌等。目前针对细菌性疾病主要依赖抗菌药物治疗,抗菌药物的使用使得养殖水体的病原菌处于选择压力的环境下,诱导病原菌产生耐药性,甚至产生多重耐药性,病原菌耐药性的产生最终会导致抗菌药物用量增加,最终无药可用,造成恶性循环。水产养殖上对细菌耐药性的研究主要集中在鱼、虾类,而对贝类相关的耐药性研究及耐药机制鲜有报道,因此本文调查4个养殖场鲍的消化道及养殖环境异养菌的耐药性,并从所获得的鲍消化道异养菌中选取对恩诺沙星敏感的哈维弧菌进行耐药性诱导,对获得的恩诺沙星耐药株(HL-R)与恩诺沙星敏感株(HL-S)进行转录组分析,从分子水平初步探究鲍体内哈维弧菌的耐药机制,为鲍细菌性疾病预防与治疗提供理论基础。  采用纸片扩散法对分离于鲍消化道及养殖水体的575株异养菌进行耐药性检测,发现菌株对青霉素G、卡那霉素、庆大霉素和利福平具有较高的耐药率(消化道异养菌耐药率范围在40%~80.65%,水体菌为27.03%~83.95%),对诺氟沙星,氯霉素、恩诺沙星耐药率较低(消化道菌为0~16.13%,水体菌为0~6.94%)。采用多步药物诱导法对哈维弧菌进行恩诺沙星的诱导,20代连续药物诱导后,诱导株的最低抑菌浓度是原菌株的32倍(16μg/mL,原菌株为0.5μg/mL),其耐药性可稳定存在。  转录组数据分析得到哈维弧菌耐药株与敏感株的差异表达基因总数为3522个,其中上调表达的基因为2620个,下调表达的基因为902个。对哈维弧菌两个样品的差异基因进行 GO功能注释,GO条目可注释到31个功能类别,其中耐药株与敏感株最主要的是“代谢过程”、“细胞组成”、“催化活性”、“结合”等功能。选出10个与耐药性相关的差异基因,分别为recA、lexA、gyrA、gyrB、acrA、acrB、tolC、marR、gene699、luxR,进行实时荧光定量PCR验证,发现与转录组数据基本一致,表明转录组数据的可靠性。通过转录组分析当哈维弧菌被诱导为恩诺沙星耐药株时,在基因水平上主要有两点发现:1、主动外排泵系统(RND、MATE、MFS、ABC)相关基因表达上调,哈维弧菌外排泵系统表达量增高;2、调控SOSr的启动基因recA表达上调,lexA表达下调,其他SOSr相关基因也上调,细菌体内启动 SOSr。以上两点的发现为以后深入探究哈维弧菌对喹诺酮类药物的耐药机制奠定分子基础。
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