目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤,胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是其最常见的类型,其侵袭性和复发率都明显高于其他颅内肿瘤。目前GBM的预后较差,5年生存率约为5%,寻找可以有效抑制GBM的药物和治疗策略具有十分重要的意义。中国自古就有应用含砷的中药来治疗多种疾病的传统,三氧化二砷（arsenic trioxide,ATO）是其主要提取成分。如何增强ATO抗胶质瘤作用,减少不良反应,使其在安全剂量下发挥抑瘤作用值得进一步研究。低强度超声（low intensity ultrasound,LIUS）可对细胞膜结构造成可逆损伤,提高细胞膜的通透性,使穿过细胞膜的化疗药物浓度升高;还可以瞬时开放血脑、血肿瘤屏障,提高血管内皮细胞的通透性。本研究在体内外水平观察LIUS增强ATO抗GBM的作用,验证其协同引起胶质瘤细胞程序性死亡的方式,探讨可能的机制。研究方法:本研究首先以胶质母细胞瘤U87 MG和U251细胞系及人星型胶质细胞（NHA）为对象。体外部分,首先分别将ATO作用不同浓度（2,4,6,8,10μM）和时间（24,48,72小时）。LIUS作用不同强度（50.4,83.4,142.0,290.0 m W/cm~2）,不同时间1,3,5分钟,每24小时一次,作用72小时,利用CCK8分析ATO和LIUS单独作用对胶质瘤细胞增殖和正常胶质细胞的影响并筛选出拟联合作用条件。接下来,利用CCK8,Ed U,流式细胞术和western blot实验,分析联合应用后对胶质瘤增殖,凋亡和对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）的影响。加入使EGFR磷酸化的底物表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）,再次利用CCK8,Ed U,流式细胞术和western blot实验,验证ATO和LIUS联合作用是否通过增强EGFR磷酸化抑制从而引起下游Akt/mTOR改变,进而影响凋亡和自噬作用,抑制胶质瘤的增殖。体内部分,构建U87MG细胞系的裸鼠原位移植瘤模型,14天后,按体外实验分组,腹腔内ATO给药,颅外照射LIUS。再作用14天后利用磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）,电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）,分析各组肿瘤大小及脑组织内砷含量差异。免疫组化实验,分析组织中各蛋白表达的差异,并绘制生存率曲线。结果:1.CCK8实验显示,当以142m W/cm~2及以上强度的超声单独作用时（1,3,5分钟）,会对胶质瘤和NHA细胞产生一定的抑制作用,呈作用强度及时间依赖性。而当强度在50.4 m W/cm~2和83.4m W/cm~2,作用时间为1,3,5分钟时,对胶质瘤增殖和NHA抑制作用不明显。单独应用ATO对胶质瘤的抑制作用呈浓度和时间依赖性。在4μM作用48,72h,6,8,10μM作用24-72h对胶质瘤均可产生抑制作用,差异有统计学意义。而在2μM,作用24-72小时;4μM,作用24小时,对U87MG和U251细胞无明显抑制作用。在本研究的ATO浓度下,对NHA细胞无明显抑制作用。综合LIUS和ATO单独作用的实验结果,在以保证人体和正常脑组织安全下的ATO浓度和LIUS强度为前提,我们选择单独作用下对胶质瘤均无明显抑制作用的ATO（2μM）和LIUS（83.4m W/cm~2）,作用72小时,为联合应用的条件。2.通过CCK8实验发现,两者联合应用后,增强了ATO抗胶质瘤作用,相对增值率为（U87MG 60.3±6.2%,U251 73.1±1.7%）,而对NHA细胞无明显抑制。Ed U实验也显示,胶质瘤细胞中,两者联合组的Ed U阳性染色细胞数比率要少于其他三组,差异有统计学意义。而对照组、LIUS组和ATO组间比较,Ed U阳性染色细胞数无明显差异。低强度超声可增强ATO对胶质瘤的增殖抑制。3.流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）结果显示:在U87 MG中,单独应用LIUS和ATO引起凋亡改变不明显,而两者联合后可引起U87 MG细胞系的显著凋亡（凋亡率为36.3±3.61%）,差异有统计学意义。在U251中,两者单独及联合应用凋亡细胞数未见明显差异改变。4.Western blot实验发现,在U87 MG细胞系中,LIUS和ATO联合可升高凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase-3的表达,而在U251细胞系中该蛋白表达无差异。通过对自噬相关蛋白LC3B和Beclin 1的分析发现,在U251中,LIUS联合ATO提高了LC3B和Beclin1表达,而在U87MG中,两者表达却降低了。同时,在U87 MG和U251细胞系中,LIUS和ATO联合可提高Bax,降低Bcl-2的蛋白表达。而对P53的调节表现出相反的趋势,以上蛋白条带灰度量化后差异有统计学意义。5.Western blot实验发现,在U87 MG和U251细胞系中,LIUS和ATO联合后EGFR、Akt、mTOR总蛋白表达无变化,而磷酸化的EGFR、Akt、mTOR表达减低,差异有统计学意义。ATO和LIUS单独作用时对以上蛋白表达作用不明显。所以,LIUS增强ATO抗胶质瘤作用可能与抑制EGFR磷酸化从而引起下游AKT/mTOR抑制有关。6.使用EGFR的激活底物EGF,并激活下游AKT/mTOR。CCK8和Ed U实验显示,LIUS和ATO联合对胶质瘤的抑制作用会因为EGF的引入而减弱,激活EGFR可以反转LIUS和ATO对胶质瘤的抑制作用。流式细胞术也提示,在U87 MG中,EGF可减轻LIUS和ATO引起的胶质瘤细胞凋亡。Western blot结果提示,EGF可拮抗LIUS和ATO引起的EGFR/AKT/mTOR通路活化抑制。对LIUS和ATO引起的凋亡相关蛋白表达有拮抗作用。对U251的自噬相关蛋白表达同时也有拮抗作用。7.体内裸鼠体内原位移植U87 MG模型进一步验证。MRI下,对照组、LIUS组、ATO组间肿瘤大小无明显差异,而ATO+LIUS联合组肿瘤体积明显小于其它组。ICP-MS对脑组织砷元素的测量也发现,ATO+LIUS联合组的脑组织砷元素含量（1466.3±102.4μg/kg）明显增高于ATO单独应用（649±71.6μg/kg）。联合应用后荷瘤鼠生存率得到提高。免疫组化发现联合组的Ki67、LC3B、p-EGFR、p-Akt、p-mTOR染色强度减低,其余各组无差异。联合组Cleaved Caspase-3、P53染色强度高于其余各组。结论:综上所述,1.LIUS联合ATO作用后,增强了药物作用,增加了脑组织内药物浓度,可以使ATO在人体安全剂量条件下发挥一定的抗胶质瘤作用。2.ATO+LIUS通过增加U87 MG的凋亡和U251的自噬引起细胞死亡,达到抑制增殖的目的。3.机制上与ATO联合LIUS作用后降低了EGFR的磷酸化激活,从而抑制下游AKT/mTOR通路有关。