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自1997年以来,多种动物相继克隆成功。但克隆效率低下和克隆动物的发育缺陷,限制了体细胞克隆技术的应用。甲状腺转录因子1 (Thyroid transcription factor 1, TTF-1)是一种同源结构域转录因子,属于NKX2家族成员,它在甲状腺、肺和前脑中表达,并调控组织特异性基因的表达;它在肺的发育和维持成体肺功能中扮演重要角色。研究TTF-1基因在克隆牛和正常牛中的表达差异和甲基化状态,对揭示克隆牛肺发育缺陷的机理有重要意义。本研究首先利用RT-PCR、反向PCR和兼并引物PCR等方法,扩增得到牛的TTF-1序列;分别提取4头克隆牛(9C1、9C3、9C4和9C8)和2头对照牛(9N1和9N4)的肺组织总RNA,利用荧光定量PCR技术检测了TTF-1在克隆牛和正常牛肺组织中的表达水平;对该基因5’端进行了甲基化分析。主要结果如下:1.分离并鉴定了牛TTF-1 2499bp的序列,包括第一外显子上游序列135bp、第一外显子77bp,第一内含子709bp、第二外显子373bp、第二内含子932bp和部分外显子三273bp。2.克隆牛9C1、9C3、9C4和9C8的TTF-1 mRNA相对表达量分别为7.95、0.81、2.94和1.53,对照牛9N1、9N4分别为6.66和4.43。各个样品间TTF-1的表达量均达到差异显著水平(P <0.05)。3.对克隆牛9C3和对照牛9N1启动子区进行甲基化分析,所有甲基化分析的序列位于内含子1内,共长约800bp。分三段序列对其分析,分别命名为CpG1、CpG2和CpG3。CpG1长410bp,含有24个CpG位点;CpG2长305bp,含11个CpG位点;CpG3长248bp,含15个CpG位点。50个CpG位点在克隆牛9C3和对照牛9N1启动子区均处于去甲基化状态。4.克隆牛9C3、9C8和对照牛9N1、9N4翻译起始位点上游序列比对结果有以下不同:在第二外显子上游-881位点处克隆牛9C3、9C8和对照牛9N1为A,而对照牛9N4为G;-741位点处克隆牛9C3、9C8和对照牛9N1为C,而对照牛9N4为A;-595位点处克隆牛9C3、9C8和对照牛9N1为C,而对照牛9N4为T;-551位点处克隆牛9C3、9C8和对照牛9N4为C,而对照牛9N1为T;-471位点处克隆牛9C3、9C8和对照牛9N1为A,而对照牛9N4为T;-311位点处克隆牛9C3、9C8和对照牛9N1为G,而对照牛9N4为A;-281位点处克隆牛9C3、9C8和对照牛9N1为T,而对照牛9N4为C;-97位点处克隆牛9C8和对照牛9N4、9N1为C,而克隆牛9C3为T。虽然这些碱基替换不位于转录因子结合位点内,但它们是否影响基因的转录还有待于进一步研究。