论文部分内容阅读
由镰孢菌引起的茎基腐病(Fusarium crown rot,FCR)目前已成为世界性的小麦土传病害,在澳大利亚、美国、地中海国家、南美、非洲及中国普遍发生,部分地区为害严重。该病可造成严重的粮食减产以及产生危害人畜健康的毒素,是世界小麦安全生产上的一个重要限制因素。中国是世界上最大的小麦生产国,茎基腐病是我国近年来新近报道的一种重要病害,由于品种感病、秸秆还田造成菌源积累等因素,该病有不断加重的趋势。本研究针对小麦茎基腐病在我国研究起步较晚,发生分布及病原种类不清等问题,通过系统调查,明确了小麦主产区黄淮麦区(Huanghuai wheat growing region,HHWGR)茎基腐病的发生分布、病原组成及优势病原的群体结构,发现该地区优势病原菌假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)种下具有丰富的遗传多样性。利用新一代测序技术对我们分离得到的该种强致病性菌株WZ-8A进行了全基因组序列测定和分析。此外,通过对基因组信息比对分析和侵染小麦时的转录组分析,本研究还鉴定了假禾谷镰孢9个水杨酸羟化酶基因并对其功能进行了初步研究。这些研究结果为病害监测与防控、病原菌致病的分子机制以及未来的抗病育种工作提供理论依据。主要研究结果如下:黄淮麦区中小麦种植面积较大的河南、山东和河北省茎基腐病为害较重,病原分离频率最高的均为假禾谷镰孢(F.pseudograminearum),其次为禾谷镰孢(F.graminearum)。此外,陕西省的茎基腐病也主要由假禾谷镰孢引起,而黄淮麦区西北部的山西省以及东南部的江苏北部和安徽省北部的FCR主要由禾谷镰孢引起的。在整个黄淮麦区,假禾谷镰孢分离频率最高(50%左右),其次为禾谷镰孢,两者的总分离频率在80%以上。对分离到的9种镰孢菌进行致病性测定,结果表明,假禾谷镰孢和禾谷镰孢是引起黄淮麦区小麦茎基腐病的主要病原,其中优势病原为假禾谷镰孢。在田间人工接种的情况下,相比于禾谷镰孢,假禾谷镰孢对小麦造成的减产明显更为严重(P<0.05),平均产量损失可达20.2~26.6%。在黄淮麦区,假禾谷镰孢群体内存在着较为丰富的遗传多样性。对194株Fpg分离物的EF-1α序列进行系统进化分析显示,这些分离物可形成分别与澳大利亚和中国Fpg标准株亲缘关系较近的两个明显不同的分支,这说明黄淮麦区Fpg群体内发生了EF-1α基因的变异,但这些变异没有地理规律性。URP分析结果表明,该地区假禾谷镰孢不同地理群体间存在着一定的基因流动(Nm=2.2252),群体内的遗传多样性在总的多样性水平中占主要比例。黄淮麦区假禾谷镰孢的分布具有一定的地理相关性。在黄淮麦区8个亚群体中,河北群体与三个河南群体的关系较近,而山东群体则与陕西和山西群体关系较近。这表明该病原的遗传变异可能与其自身特性(有性生殖困难)、生境条件(不同地区的气候、土壤条件和耕作制度不同)和人为因素(植物种子交流和机械跨区域作业等)有关。本研究获得了黄淮麦区假禾谷镰孢WZ-8A的高分辨率基因组信息,基因组长度为37.5Mb,测序深度为140×,其中包含10个Contigs、6个scaffold和4个gaps,contig N50为7.8Mb,scaffold N50为9.0Mb,说明本次测序质量较高。通过基因组注释,共得到功能基因12234个,占总基因数的99.12%,其中包含可能参与Fpg致病过程的1790个细胞壁降解酶(CAZyme)、36个次级代谢基因簇和1266个分泌蛋白。比较基因组学分析显示,WZ-8A的基因组与澳大利亚菌株CS3270呈高度共线性关系,在各染色体末端和近着丝粒附近出现较多的基因变异。通过基因组信息比对和侵染小麦过程中的转录组分析,鉴定了假禾谷镰孢9个水杨酸羟化酶基因。转录组测序结果显示,在这些基因中,Shy1、Shy2、Shy4、Shy5和Shy8显著上调表达,其中Shy4可能在Fpg侵染小麦时被诱导表达,另外,Shy9可能下调表达,其余Shys基因则未检测到表达量。利用split-PCR法对这9个基因分别进行单敲除,成功获得了9个水杨酸羟化酶基因(包括2个Nah G型、6个Nah W型和一个其他类型的基因)的敲除转化子,并通过基因克隆与遗传转化的方式获得各基因的回补转化子。对这些转化子进行基本表型检测显示,Nah G型Shys基因的转化子对假禾谷镰孢的菌丝生长、产孢和致病性均无明显影响,但Shy1可以影响对水杨酸的降解过程;Nah W型的shy4、shy8和shy9敲除转化子在PDA上生长时出现了明显的色素合成和沉积方式的改变,说明这3个基因可能参与了假禾谷镰孢的色素合成过程。致病性试验显示,这3个基因敲除转化子的致病性降低,说明还参与了假禾谷镰孢的致病过程。