小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢的遗传多样性及水杨酸羟化酶基因功能分析

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由镰孢菌引起的茎基腐病(Fusarium crown rot,FCR)目前已成为世界性的小麦土传病害,在澳大利亚、美国、地中海国家、南美、非洲及中国普遍发生,部分地区为害严重。该病可造成严重的粮食减产以及产生危害人畜健康的毒素,是世界小麦安全生产上的一个重要限制因素。中国是世界上最大的小麦生产国,茎基腐病是我国近年来新近报道的一种重要病害,由于品种感病、秸秆还田造成菌源积累等因素,该病有不断加重的趋势。本研究针对小麦茎基腐病在我国研究起步较晚,发生分布及病原种类不清等问题,通过系统调查,明确了小麦主产区黄淮麦区(Huanghuai wheat growing region,HHWGR)茎基腐病的发生分布、病原组成及优势病原的群体结构,发现该地区优势病原菌假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)种下具有丰富的遗传多样性。利用新一代测序技术对我们分离得到的该种强致病性菌株WZ-8A进行了全基因组序列测定和分析。此外,通过对基因组信息比对分析和侵染小麦时的转录组分析,本研究还鉴定了假禾谷镰孢9个水杨酸羟化酶基因并对其功能进行了初步研究。这些研究结果为病害监测与防控、病原菌致病的分子机制以及未来的抗病育种工作提供理论依据。主要研究结果如下:黄淮麦区中小麦种植面积较大的河南、山东和河北省茎基腐病为害较重,病原分离频率最高的均为假禾谷镰孢(F.pseudograminearum),其次为禾谷镰孢(F.graminearum)。此外,陕西省的茎基腐病也主要由假禾谷镰孢引起,而黄淮麦区西北部的山西省以及东南部的江苏北部和安徽省北部的FCR主要由禾谷镰孢引起的。在整个黄淮麦区,假禾谷镰孢分离频率最高(50%左右),其次为禾谷镰孢,两者的总分离频率在80%以上。对分离到的9种镰孢菌进行致病性测定,结果表明,假禾谷镰孢和禾谷镰孢是引起黄淮麦区小麦茎基腐病的主要病原,其中优势病原为假禾谷镰孢。在田间人工接种的情况下,相比于禾谷镰孢,假禾谷镰孢对小麦造成的减产明显更为严重(P<0.05),平均产量损失可达20.2~26.6%。在黄淮麦区,假禾谷镰孢群体内存在着较为丰富的遗传多样性。对194株Fpg分离物的EF-1α序列进行系统进化分析显示,这些分离物可形成分别与澳大利亚和中国Fpg标准株亲缘关系较近的两个明显不同的分支,这说明黄淮麦区Fpg群体内发生了EF-1α基因的变异,但这些变异没有地理规律性。URP分析结果表明,该地区假禾谷镰孢不同地理群体间存在着一定的基因流动(Nm=2.2252),群体内的遗传多样性在总的多样性水平中占主要比例。黄淮麦区假禾谷镰孢的分布具有一定的地理相关性。在黄淮麦区8个亚群体中,河北群体与三个河南群体的关系较近,而山东群体则与陕西和山西群体关系较近。这表明该病原的遗传变异可能与其自身特性(有性生殖困难)、生境条件(不同地区的气候、土壤条件和耕作制度不同)和人为因素(植物种子交流和机械跨区域作业等)有关。本研究获得了黄淮麦区假禾谷镰孢WZ-8A的高分辨率基因组信息,基因组长度为37.5Mb,测序深度为140×,其中包含10个Contigs、6个scaffold和4个gaps,contig N50为7.8Mb,scaffold N50为9.0Mb,说明本次测序质量较高。通过基因组注释,共得到功能基因12234个,占总基因数的99.12%,其中包含可能参与Fpg致病过程的1790个细胞壁降解酶(CAZyme)、36个次级代谢基因簇和1266个分泌蛋白。比较基因组学分析显示,WZ-8A的基因组与澳大利亚菌株CS3270呈高度共线性关系,在各染色体末端和近着丝粒附近出现较多的基因变异。通过基因组信息比对和侵染小麦过程中的转录组分析,鉴定了假禾谷镰孢9个水杨酸羟化酶基因。转录组测序结果显示,在这些基因中,Shy1、Shy2、Shy4、Shy5和Shy8显著上调表达,其中Shy4可能在Fpg侵染小麦时被诱导表达,另外,Shy9可能下调表达,其余Shys基因则未检测到表达量。利用split-PCR法对这9个基因分别进行单敲除,成功获得了9个水杨酸羟化酶基因(包括2个Nah G型、6个Nah W型和一个其他类型的基因)的敲除转化子,并通过基因克隆与遗传转化的方式获得各基因的回补转化子。对这些转化子进行基本表型检测显示,Nah G型Shys基因的转化子对假禾谷镰孢的菌丝生长、产孢和致病性均无明显影响,但Shy1可以影响对水杨酸的降解过程;Nah W型的shy4、shy8和shy9敲除转化子在PDA上生长时出现了明显的色素合成和沉积方式的改变,说明这3个基因可能参与了假禾谷镰孢的色素合成过程。致病性试验显示,这3个基因敲除转化子的致病性降低,说明还参与了假禾谷镰孢的致病过程。
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