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近年来，CRISPR/Cas系统在基因工程技术和生物医药等领域掀起了突破性的革命。来自于细菌的适应性免疫系统，CRISPR/Cas系统已经被开发成为一个多功能的基因研究平台。利用DNA核酸酶失活的Cas蛋白不会诱变靶DNA序列的特性，CRISPR/Cas系统又被应用于基因转录调控，染色体成像以及基因表观遗传修饰等领域。本研究着眼于新报道的Ⅴ型CRISPR系统，探索其在基因转录调控中的应用。Ⅴ型CRISPR系统的效应蛋白为Cas12a，其不光在识别PAM基序上可以与Cas9形成互补，拓展CRISPR系统的应用范围。而且缺失DNA核酸酶活性的ddCas12a还具有RNAase活性，可以加工前体crRNA使其成熟，我们通过串联转录多个crRNA实现了多基因转录调控，简化了多基因转录调控操作。此外，通过筛选crRNA DR基序突变文库，建立靶向抑制不同强度的crRNA DR基序数据库，开发精准的CRISPRi方法。本研究拓宽了CRISPR/ddCas12a系统在基因转录调控上的应用范围，同时为该系统应用于其他领域提供参考。 主要研究内容分为以下三个部分: 1.CRISPR/ddCas12a系统介导的多基因转录调控研究 CRISPR/dCas9系统被广泛应用于研究基因的转录调控和表观遗传学修饰。然而，需要转染多个sgRNA质粒才能利用CRISPR/dCas9系统实现多基因的转录调控研究。为了简化实验方案，我们利用ddCas12a为效应蛋白进行多基因的转录调控研究。在大肠杆菌中，我们首先证明了crRNA介导的ddCas12a可以对靶基因进行转录抑制，且crRNA靶向到编码区的模板链时可以介导ddCas12a对靶基因进行较好的转录抑制作用，这个与dCas9不同。当ddCas12a/crRNA复合体靶向到基因的启动子区域的模板链和非模板链时，对靶基因均有较好的转录抑制作用。通过全转录组RNA-seq实验，我们证明了ddCas12a/crRNA介导的转录抑制作用具有很高的特异性。此外，本文还证明了ddCas12a蛋白所保留的RNase活性在体内能够加工串联转录的多个crRNA，以产生多个成熟的crRNAs，进而实现多靶标基因的转录抑制。利用这一多基因转录调控策略，本文展示了在大肠杆菌双组分系统中快速筛选靶标基因功能的CRISPRi方法。因此，基于本文的发现，CRISPR/ddCas12a系统介导的多基因转录调控可以被广泛应用于基因组学和临床研究中。 2.CRISPR/ddCas12a系统介导的可控、定量化的转录调控研究 CRISPR/ddCas12a系统缺失了基因编辑活性，而被广泛应用于研究基因的转录调控和表观遗传学修饰。然而，对于特定的靶位点，很难利用CRIPSR/ddCas12a系统对靶基因实现精准的转录调控。本研究在CRIPSR/ddCas12a系统介导基因转录调控的基础上，意在开发可控、精准的CRISPRi方法，并阐明其作用机制。首先，我们在大肠杆菌中建立了通过荧光信号强度反应gfp转录抑制效率的报告系统，且该系统获得实验结果与荧光定量PCR的实验结果有很好的相关性，R2为0.9953。其次，通过构建crRNA DR基序突变文库，结合gfp荧光报告系统和流式分选技术，我们分析了不同DR基序的crRNA介导转录抑制的效率，建立了靶向抑制不同强度的crRNA DR数据库。通过M fold软件预测RNA二级结构，我们发现可以介导较强转录抑制效率的crRNA DR基序的二级结构与野生型的二级结构相似，相反，介导较低转录抑制效率的crRNA DR基序的二级结构与野生型的二级结构存在较大差异。选择合适的DR基序，构建crRNA质粒，通过靶向到报告基因DsRed和内源性proP基因上，我们证明了精准CRISPRi方法具有很好的通用性和普遍适用性。通过RNA凝胶迁移实验，我们证明了不同DR基序的crRNA与ddCas12a、靶DNA间亲和力存在差异。与转录抑制效率相一致，当crRNA与ddCas12a、靶DNA间亲和力较强时，它介导的转录抑制效率也较高(如10-5B);当crRNA与ddCas12a、靶DNA间亲和力较低时，它介导转录抑制效率也比较低(如10-7B)。总的来说，我们证明了可以通过选择不同的DR基序来定量化调控靶基因的转录抑制。基于以上的发现，精准的CRISPRi方法可以被广泛应用于基因组学和临床研究当中。 3.免疫增强重组BCG菌株的研制 BCG是目前市面上唯一批准使用的抗结核减毒活疫苗，而且膀胱灌注BCG也被公认为是预防膀胱癌术后复发的最佳方法之一。但是大剂量使用BCG会诱发一定的副作用，加之肿瘤特异性差等因素，使得免疫疗法的应用受到限制。NY-ESO-1是迄今发现的最具免疫原性的肿瘤抗原之一，被认为是最好的肿瘤候选疫苗之一。本研究以提高肿瘤应答的特异性和增强肿瘤局部免疫应答强度为目标，将肿瘤特异性抗原NY-ESO-1作为抗肿瘤研究的模式分子，联合合成生物学调控元件设计，构建定向和高效表达NY-ESO-1的重组BCG，通过western blot，我们证明了重组BCG菌株可以很好的表达NY-ESO-1，且蛋白有很好的反应原性。通过体外细胞学实验和小鼠免疫试验，获得重组BCG菌株诱导局部和全身免疫应答的格局。结果显示，将两种重组BCG菌株免疫小鼠后，小鼠的脾脏细胞在体外再次接受抗原刺激后可产生PPD和NY-ESO-1特异性T细胞免疫应答，且经rBCG-N2免疫后的小鼠脾脏细胞能产生更多的抗原特异性T细胞免疫应答。同时发现经rBCG免疫后的小鼠脾脏细胞可以产生Th1型细胞免疫应答。结果表明，人工设计的重组BCG菌株可以诱导小鼠产生NY-ESO-1特异性的细胞免疫应答，有望在未来尝试用于表达NY-ESO-1的膀胱癌患者的灌注治疗，以提高BCG灌注治疗膀胱癌的临床疗效。