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本实验利用贴壁特性在体外分离、纯化及扩增骨髓间充质干细胞,并在体外适宜培养条件下诱导其向神经细胞转化;应用DAPI荧光标记、激光共聚焦显微镜观察及免疫组化等方法,观察MSCs及其神经细胞转化后经局部或血管途径移植在缺血再灌注及机械毁损模型大鼠脑组织中的迁移、分布及在脑组织损伤区域定居;应用病理切片及新鲜脑组织坏死体积检测等方法,观察MSCs及其神经转化后对模型大鼠的治疗效果。并进一步揭示MSCs脑保护作用及作用机制,为MsCs治疗脑血管疾病提供实验依据。结果显示:1. MSCs分离、纯化及其体外培养的形态学特征镜下观察发现,培养3天后,可见贴壁细胞,细胞形态以圆形为主。7天后,悬浮细胞、圆形血细胞明显减少,少量梭形或纺锤形成纤维样细胞开始出现。培养2～3代后,绝大部分为细长梭形细胞,也有扁平形带突起的细胞,有明显的梭形细胞集落呈克隆样生长。细胞传代6～7代后,形态无明显变化,但扁平形的大细胞增多,梭形细胞减少,细胞呈指数增长。流式细胞仪直接荧光法检测细胞周期显示, 85.87%的细胞处于G0-G1期,表明所检测细胞具有MSCs的生长特性。2. MSCs体外诱导神经转化及鉴定倒置显微镜观察,MSCs在30～40min开始,即发生形态变化,扁平、梭形细胞胞浆回缩,向核集中,形成一个呈水滴样的细胞体,并可见小的突起从细胞膜向外伸出,1～3d后,细胞的突起伸长,圆形胞体折光增强,可出现其它的突起,类似于神经样细胞的假足。可见分化细胞有多个突起,胞浆少,细胞核圆形或椭圆形,较未分化细胞深染。诱导后的神经元样细胞用NSE进行免疫组化鉴定,显微镜下观察绝大部分细胞棕色浓染色,为阳性细胞。3.大鼠偏瘫及脑毁损模型制备及鉴定偏瘫模型大鼠清醒后,可见右侧肢体瘫痪,以前肢为重。提尾时大鼠右前肢屈曲、内收、行走时向右侧转圈或倾倒、偏瘫、肢体强直等。4. MSCs及其神经转化后在大鼠脑组织中迁移、分布及归巢在损伤区域在毁损脑组织的长轴远端注入标记的诱导后神经元样细胞及血管途径注入标记的MSCs,结果发现,标记DAPI的诱导后神经元样细胞在注入后第一天即在毁损脑组织区域血管内出现;第五天,损伤组织血管及其周围组织有标记的MSCs弥散;注入后第十天损伤组织内荧光标记的MSCs广泛弥散。5. MSCs及其体外诱导的神经元样细胞对脑损伤修复作用HE染色后光镜下可见,大鼠中动脉线栓2小时再灌注后24小时,正常对照在各时间点神经元结构、形态正常。偏瘫模型组、PBS注入组和MSCs治疗组均可见到明显梗死灶,神经纤维疏松,间质水肿明显;脑缺血再灌注5d,偏瘫模型组、PBS注入组脑损伤仍较严重,MSCs治疗组病理变化较另外两组开始减轻;脑缺血再灌注10d后,MSCs组病理变化较另外两组神经细胞变性、坏死数量明显变少,间质水肿较轻。新鲜脑片染色显示,正常组动物,在各时间点大脑脑片均呈现鲜艳的红色,无白色区域出现;脑缺血再灌注24h后,偏瘫模型组、PBS注入组和MSCs治疗组动物大脑脑片出现大量白色区域,并且主要集中在左侧结扎缺血区;10d后,各组动物脑片均出现不同程度的变化。偏瘫模型组、PBS注入组死面积变化较轻微,而MSCs治疗组变化明显,白色区域减少,脑片中红色区域增加。研究结果表明,本研究成功的建立大鼠偏瘫及脑毁损的脑损伤模型、分离纯化并体外扩增MSCs、体外诱导MCSs神经分化,证实了体外诱导的神经元样细胞在损伤远端注入后,可向损伤组织趋化并定居。并进行旺盛的增殖与分化,促进组织损伤的修复。总之,本实验为MSCs及诱导其神经分化后移植治疗缺血性脑血管疾病或机械性脑损伤提供了实验依据。MSCs有望成为治疗脑血管疾病和脑组织损伤的较为理想的种子细胞。但这些细胞是否能同宿主神经细胞建立突触联系,如何参与了宿主神经功能的重建,还有待于进一步研究证实。