背景和目的：短QT综合征（short QT syndrome，SQTS）是一种新发现的，以短QT间期伴室性心动过速（室速）、心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）、阵发性心房颤动（房颤）为特征，而心脏结构正常的一类遗传性离子通道疾病。到目前为止，已先后发现6个编码钾通道和钙通道亚单位致病基因(KCNH2、KCNQ1、KCNJ2、CACNA1C、CACNB2b及CACNA2D1)，提示SQTS存在遗传异质性。长QT综合征（LQTS），是以长QT间期，室速，SCD为主要特征的另一种遗传性心脏离子通道病。LQTS和SQTS是表型相反的两种心脏复极化异常疾病。目前，4个导致SQTS基因（KCNQ1, KCNH2, KCNJ2及CACNA1C)的相反功能突变导致SQTS相反表型-LQTS。SCN5A基因，负责编码心脏电压门控钠离子通道α亚基-Nav1.5。已证实，SCN5A基因功能获得突变导致LQTS。然而，迄今为止，尚无SCN5A基因突变在LQTS相反表型-SQTS中的报道。据目前资料信息，除了国人SQTS中发现KCNH2基因突变报道外，系统性对国人SQTS的研究报道罕见。因此，筛查我国SQTS患者的致病基因及其突变位点，揭示国人SQTS分子遗传机制及电生理发病机制是本研究主要目标。结合国人SQTS基因型研究结果，初步筛选有效的针对国人SQTS的抗心律失常药物，是本研究另一个目的。材料和方法：临床资料收集按照国际短QT综合征诊断指南（国际心电图指南2010），收集QT间期缩短(QTc≤370ms)的患者以及家族成员资料。所有患者进行详细临床评估，以及排除继发性QT间期缩短因素。基因筛查对已知SQTS致病基因（KCNQ1、KCNH2、KCNJ2、CACAN1C、CACNB2、CACNA2D1）及候选SCN5A基因的编码区，外显子和内含子交界区通过DNA直接测序法进行筛查。100个相同种族背景的健康个体作为对照，以鉴别罕见基因突变与普通基因多态性。根据最新SQTS诊断标准，对每位患者进行评分。体外突变诱导及细胞转染通过定点突变诱导技术，对携带野生型SCN5A cDNA的pcDNA3.1+进行突变诱导。诱导突变引物如下： E428G正向引物5’gctgagaccgGggagaaggaaaagcgcttccag3’和反向引物5’ttccttctccCcggtctcagcgatggtggcttg3’; V1951L正向引物sense primer5’atcgcctacTtgatgagtgagaacttctc3’和反向引物primer5’tcactcatcaAgtaggcgatgaggccctc3’; S1653S正向引物sense primer5’tgccctcatgatgtcActgcctgccctcttcaacatcg3’和反向引物5’tgaagagggcaggcagTgacatcatgagggcaaagagc3’. R689H正向引物5’tgctggaaccAtctcgcccagcgctacctg，反向引物5’ctgggcgagatggttccagcatggtggac。突变诱导后进行DNA测序验证，以及排除由PCR导致非目的碱基改变。通过脂质体转染突变型及野生型SCN5A表达质粒，至人胚肾(HEK)293细胞进行表达。细胞膜片钳电生理分析应用全细胞膜片钳技术对HEK293细胞表达的离子通道功能进行检测。分析野生型通及突变型通道的电生理特征，如电流密度、峰值，门控特性如电压依赖的稳态激活（SSA）及稳态失活（SSI）等。对抗心律失常药物乙胺碘呋酮（胺碘酮）、美西律以及普罗帕酮作用突变通道的效果进行评价，以筛选经济、有效的SQTS治疗药物。所有记录均在室温下进行。结果：临床特征共入选符合条件无相关患者10例，QTc261-362ms，年龄15-48岁，女性患者3例。5例患者存在室速，3例患者有晕厥史，3例患者存在SCD家族史。所有患者均拒绝接受心内电生理检查。基因型-表型共发现3个SCN5A基因杂合子错义突变，分别为E428G，V1951L和R689H。E428G突变：SCN5A基因第1283位核苷酸由A变为G(c.1283A＞G)，从而导致Nav1.5蛋白第428位氨基酸由谷氨酸变成甘氨酸。V1951L突变：SCN5A基因第5851位核苷酸由G变为T(c.5851G＞T)，从而导致Nav1.5蛋白第1951位氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸。 R689H突变： SCN5A基因第2066位核苷酸由G变为A(c.2066G＞A)，从而导致Nav1.5蛋白第689位氨基酸由精氨酸变成组氨酸。在相同种族背景的200个正常对照染色体中没有发现上述三个突变。E428G突变存在于6号先证者，由于反复发生室速而频发晕厥，ECG提示QTc270ms，短阵室速，频发室早。遗憾的是，E428G先证者的家族成员拒绝提供血样本，限制了我们对一级亲属的基因筛查以及遗传规律的观察。V1951L突变存在于8号先证者，反复心悸和晕厥，ECG提示QTc347ms， I，aVL，II，III， aVF及V4-V6导联早期复极化改变。其父亲45岁，携带相同基因突变，存在心悸症状，但ECG正常。8号先证者及其父亲同时还携带SCN5A基因S1653S多态性-SCN5A基因第4959位核苷酸由C变为A(c.4959C＞A)，从而导致Nav1.5蛋白第1653位氨基酸由丝氨酸变成丝氨酸。R689H突变存在于10号先证者，ECG提示QTc348ms，II，III，aVF导联早期复极化以及Brugada样ECG改变，无相关临床症状，但存在SCD家族史。参照SQTS诊断标准，3例携带基因突变的先证者积分均≥4分，提示SQTS诊断。在其它先证者中均未发现SCN5A基因以及SQTS已知致病基因的突变。电生理特性野生型及突变型(E428G，V1951L，S1653S，R689H)钠通道均成功在HEK293细胞表达。与野生型相比，E428G突变型通道表现为显著的INa峰值降低，稳定状态激活曲线与稳定状态失活曲线无明显变化。V1951L通道表现为INa密度降低趋势，但无统计学意义，其它通道特性如INa峰值，电压依赖的SSA与SSI与野生型相比，无明显差异。S1653S通道在INa密度、峰值，SSA与SSI方面与野生型基本相同。为了解释V1951L携带者明显致心律失常表型，本研究设计了V1951L与S1653S双变异钠通道，有趣的是，V1951L与S1653S共转染通道产生明显的电生理特性改变，表现为INa密度及峰值显著的降低，SSA与SSI超极化方向转移。R689H通道不产生任何电流，提示突变功能丧失。胺碘酮(50uM)、美西律(50uM)，以及普罗帕酮(50uM)三种药物，只有普罗帕酮增加E428G通道电流，具有统计学意义。胺碘酮、美西律以及普罗帕酮均导致E428G通道电压依赖SSA及SSI明显向超极化方向转移。胺碘酮，美西律对E428G突变型通道峰电流不产生明显影响，而普罗帕酮能够使E428G通道峰电流增加10%。讨论和结论：本研究首次发现国人STQS患者SCN5A基因E428G、V1951L和R689H突变，及新发S1653S同义多态性。进一步通功能分析，发现SCN5A突变离子通道蛋白的功能丧失，提示SQTS可能与基因突变有关。本研究对这携带突变的先证者也进行了已知SQTS致病基因KCNQ1,KCNH2,KCNJ2, CACNA1C、CACNB2、CACNA2D1）的筛查，未发现基因突变。三个先证者，均表现为心电图上短QT间期（分别为QTc:270ms,347ms，348ms），SCD高风险，以及无潜在的心脏结构异常。同时，获得性的QT缩短因素也被排除，如代谢紊乱（高钾血症、高钙血症、酸中毒、洋地黄中毒、心动过速）、发热、急性心肌梗死超急性期、甲状腺功能亢进、自主神经张力失衡、早期复极综合征、药物（ATP敏感钾通道开放剂，最近报道的抗癫痫药物卢非酰胺，合成类固醇激素）等。参照最新的2011年SQTS诊断标准，E428G先证者评分为7分，V1951L和S1653S先证者为5分，R689H先证者为6分，均≥4分，这表明两个携带突变的先证者均完全符合SQTS诊断。综合上述分析，表明SCN5A基因突变E428G、V1951L和S1653S及R689H均分别与SQTS疾病的明显相关性。至此，一个新的SQTS基因型-SQTS7在中国患者中发现。10号先证者为无症状的QT间期缩短患者，通过基因筛查，发现存在SCN5A基因突变R689H，进一步功能学分析表明R689H通道不产生任何电流，提示钠通道功能完全丧失。基因检测排除了SQTS已知致病基因突变引起该疾病表型的可能，结合SCN5A突变及其功能分析的结果，有理由认为SCN5A基因R689H突变与短QT间期表型以及SCD家族史有高度相关性。然而，本例患者一直未出现恶性心律失常相关症状，如晕厥、CA等，这表明了遗传性心脏疾病SQTS表型的不完全外显性。本例患者ECG除QT缩短外还表现为Brugada样心电图改变，以及II,III,aVF导联早期复极化改变，提示短QT和早期复极化并存。事实上，最近有研究也发现有相当比例的QT间期缩短患者存在早期复极化综合征，反之亦然。目前，对于短QT间期与早期复极化并存的机制尚不完全明了。SCN5A基因E428G突变，之前未有在遗传性心律失常中报道。本研究首次发现E428G突变存在于国人SQTS患者。E428G位于Nav1.5通道蛋白的DomainI和Domain II之间的细胞内连接区。E428G通道在外源性表达系统的电生理特性表现为INa峰值的显著降低，提示SCN5A基因E428G突变明显的功能丧失作用，这与E428G突变携带者具有明显的致心律失常表型相符合。同时也提示Nav1.5通道蛋白Domain I和Domain II之间的细胞内连接区在维持INa峰值方面发挥了重要的作用。E428G通道的门控特性如SSA曲线与SSI曲线，与野生型相比，无明显差异。遗憾的是，E428G先证者家族成员拒绝提供家系标本，限制了我们对一级亲属致病基因筛查和遗传方式及规律的观察。既往文献报道SCN5A基因V1951L突变，在LQTS以及新生儿猝死综合征患者中发现，在BrS患者中作为一个致病基因突变。然而，Akerman MJ等发现SCN5A基因V1951L作为一个普通的基因多态性，存在于健康西班牙人群，其发生率为6.7%，而在非西班牙种族的健康人群中，未发现V1951L变异。这表明SCN5A基因V1951L是一个相对种族特异性的基因变异。本研究在200个正常健康对照的汉族等位基因中未发现V1951L变异（发生率<0.5%），提示V1951L在汉族人群中仍是少见的基因突变，这与其它研究的结果是一致的。功能分析显示V1951L通道的电生理特性与野生型相比，不存在明显差异。这与其它研究对V1951L的功能分析结果是一致的。然而，本研究中V1951L突变携带者却表现为明显的致心律失常表型，这与V1951L通道无明显功能异常的电生理特性明显不相符合。考虑到V1951L先证者同时携带SCN5A基因S1653S多态性，促使我们考虑到是否S1653S多态性在导致患者疾病表型中发挥作用，S1653S多态性是否修饰了V1951L通道的生物学功能？我们设计了S1653S并V1951L(V1951L和S1653S)双变异的SCN5A基因定点突变诱导进行生物学功能分析。十分有趣的是，V1951L和S1653S双变异通道产生明显的生物学功能改变，表现为通道电流密度显著下降。这提示SCN5A基因S1653S多态性对V1951L突变的生物学功能产生了显著的协同调节作用，同时S1653S多态性也是疾病表型重要的基因修饰因子。因此，SCN5A基因V1951L和S1653S双变异导致钠通道显著的功能学改变，与V1951L和S1653S携带者明显的致心律失常疾病表型相符合。有趣的是，这种现象与传统的理论，即同义多态性由于没有改变蛋白质最终的氨基酸序列而不会导致蛋白功能改变，不相符合。晚近研究证实了一种新理论，即同义多态性也可以导致蛋白功能显著的改变。虽然确切的机制不清楚，需要未来的进一步研究，但本研究的结果确提供了很强的证据来支持这种全新的理论，即同义多态性可以改变蛋白质的功能而导致疾病发生。SCN5A基因E428G突变、V1951L和S1553S双变异均导致钠通道产生显著功能丧失作用，以及明显的致心律失常表型-SQTS。这使得我们首次认识到钠通道的功能丧失和SQTS的关联。虽然SCN5A基因功能丧失突变导致SQTS的确切机制尚不清楚，但有以下证据支持：1.心肌细胞钠通道功能丧失可以导致动作电位（action potential，AP）总的内向离子电流减少，导致AP内向离子流和外向离子流之间的平衡破坏，造成除极化储备减少。如果复极化速度不变，那么AP复极化时间将会减少， APD、ERP以及QT间期也会相应缩短。2.晚近基于人群大样本的关联研究证实QT间期与SCN5A基因变异有关。3.SCN5A基因功能丧失突变导致INa的降低，减慢了心脏电传播速度，有助于折返激动波的维持，从而增加了室速/室颤的易感性。4.钠通道和钙通道均负责着AP内向离子流。钙通道的功能丧失和SQTS的相关性已经得到证实。5.钠通道和钙通道的功能获得均可导致LQTS。钙通道的功能丧失导致了与LQTS相反的表型-SQTS。6.最近，研究者开始认识到早期复极化综合征患者中有很大一部分存在QT间期缩短，反义亦然。而SCN5A基因功能丧失突变和早期复极化的关系已经证实。7.越来越多的证据表明BrS和SQTS是等位基因疾病。已经证实SCN5A基因突变可以导致BrS。8.阻滞钠通道可以缩短QT间期，加重BrS的ST段抬高程度，增加恶性心律失常发生风险。本研究发现普罗帕酮能够增加E428G通道电流，提示普罗帕酮对E428G通道造成的功能丧失具有一定程度的改善作用，普罗帕酮可能是一个新的，有潜力的药物来治疗E428G突变所致SQTS。对于其它SCN5A突变引起的SQTS，普罗帕酮是否有效尚不清楚。本研究发现普罗帕酮导致E428G通道的门控特性-电压依赖的SSA与SSI曲线均显著超极化方向转移，提示SSI超极化方向转移导致的钠电流减少，可以被SSA超极化方向改变导致的钠电流增加抵消。同时也提示普罗帕酮增加E428G突变钠通道电流的作用，不是通过改变钠通道SSA和SSI而导致的。普罗帕酮增加E428G突变钠通道电流的确切机制，目前尚不清楚。是否普罗帕酮也作用于E428G突变型钠通道的失活相，以及普罗帕酮是如何对抗E428G突变导致的钠电流减少，需要在未来研究中进一步阐明。总之，本研究首次报SCN5A基因功能丧失突变(E428G和R689H)导致SQTS一种新的亚型SQTS7。SCN5A基因同义多态性S1653S对V1951L突变的生物学功能具有明显的协同作用，并导致钠通道功能丧失。与SQT1类似，普罗帕酮可能对SCN5A基因E428G突变致SQT7治疗有效。