研究背景与目的:最新的流行病学结果显示,肺癌发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中居首位,其中非小细胞肺癌(NSCLC)患者约占80-85%。近年来,尽管在肺癌综合治疗方面已经取得了巨大的进展,但是NSCLC的预后仍然较差,5年生存率不到20%,导致NSCLC治疗失败的主要原因仍是复发与转移,以及药物耐受。因此,如何进一步阐明肺癌转移与复发的分子机制,识别新的驱动转移的关键因素,是亟待解决的重大医学课题。p53基因是人体内最重要的抑癌基因之一,功能十分强大。野生型p53通过转录调控下游众多的靶基因促进细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和衰老、维持基因组稳定性。P53在超过50%的人类癌症中发生突变。p53发生突变后,会丧失野生型p53所具有的抑癌基因功能,这称为mutp53的“功能缺失”(Loss of function)。与此同时,mutp53获得了一系列类似癌基因特性的功能,例如转录一系列靶基因加速癌症进程、增强癌细胞化学耐药性、促进肿瘤转移的发生,这一过程被称为mutp53的“功能获得”(Gain of function)。如新近的研究显示突变型p53-R273H在NSCLC中通过转录激活Notch1等靶基因促进肿瘤的侵袭转移。尽管p53突变在肿瘤的起始与进展中的重要作用已是众所周知,但是对于p53在众多肿瘤中为何有如此高的突变率,机制仍然并不清楚。最新的研究结果显示,胞嘧啶脱氨基酶APOBEC3B的异常表达与p53的高突变率密切相关。APOBEC3B(A3B)属于载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽(apolioprotein B m RNA-editingenzyme catalytic polypeptide,APOBEC)家族成员,是一类高效的胞嘧啶核苷酸脱氨酶。A3B及其家族成员已经被证实对单链DNA和RNA上的胞苷有脱氨基作用,可以通过诱发靶基因上的胞嘧啶脱氨基成为尿嘧啶(C>U)导致基因组C-T或C-G的突变,这一作用一方面使A3B具有抗病毒固有免疫活性,另一方面,A3B对宿主基因组DNA有强大的致基因突变作用。大量研究显示,A3B在多种肿瘤(包括乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、肝癌等)中呈持续高水平表达,并且A3B表达通过经典癌基因的突变与癌症相关联已经得到广泛的证实。Burns团队发现A3B在多数原发乳腺癌和乳腺癌细胞株中表达上调,同时,A3B高表达使肿瘤内的基因总的突变率上调超过2倍,并更易于在p53多位点产生突变。Shumei Yan等在一项回顾性研究中发现A3B在肺癌中异常表达,且其表达与肺癌的总生存率及TNM分期密切相关,提示A3B在肺癌的发生发展中发挥重要作用。但迄今为止,A3B在肺癌发生发展中的作用及机制仅有零星报道。为了探索A3B在肺癌发展与进化中的作用,本研究拟通过细胞模型,动物实验、临床标本检测等手段阐明A3B在肺癌进化发展尤其是转移的密切关系,为深入阐明驱动肺癌转移的关键因子,克服肺癌转移开发新的干预策略提供理论依据。研究方法:1.RT-q PCR和western blot检测肺癌细胞系和正常肺上皮细胞的A3B表达水平,选取A3B表达相对低的HCC827细胞系作为下一步研究对象。2.极限稀释法获得由HCC827单克隆起源的HCC827/B3细胞。接着通过Cas9-SAM技术构建A3B过表达的慢病毒载体,首先用Cas9-VP64慢病毒感染细胞,经嘌呤霉素筛选,得到的稳定细胞用重组sg RNA-GV419慢病毒感染,经G418最终筛选出稳定的A3B过表达细胞系B3/A3B,RT-q PCR和western blot方法验证A3B表达水平。3.A3B通过碱基脱氨基作用将胞嘧啶转换为尿嘧啶,经UDG酶作用下,糖苷键断裂,随后经碱基切除修复作用,产生无嘌呤无嘧啶位点(AP位点),AP位点越多反映A3B的体外脱氨酶活性越高。AP assay试剂盒检测B3/A3B细胞以验证过表达细胞系中胞嘧啶脱氨酶体外活性。4.Transwell侵袭实验检测A3B过表达细胞B3/A3B和对照细胞B3/control的侵袭转移能力,划痕和Transwell转移实验检测细胞的迁移能力。同时构建小动物肺癌转移模型,从裸鼠尾静脉B3/A3B和B3/control细胞后,35天后处死小鼠取完整肺组织制作石蜡包埋标本,HE染色下观察肺组织癌转移情况。5.Sanger测序法对构建的A3B过表达细胞系进行P53第5-8号外显子测序,分析p53突变情况。收集74例非小细胞肺癌组织标本,一方面通过测序检测P53基因第5-8号外显子突变情况。另一方面对对应标本进行免疫组化检测A3B表达,分析p53突变与A3B表达之间的相关性。6.利用si RNA瞬时转染技术在B3/A3B细胞中干扰p53的表达,通过划痕实验和小室侵袭实验检测细胞侵袭转移能力的变化,反向验证p53是否参与A3B过表达后细胞表型改变的过程;在P53缺失的细胞株H1299中过表达A3B,检测在缺乏p53作用下A3B对细胞侵袭迁移能力的影响。进一步验证了细胞不同处理后转移相关蛋白水平的变化。7.收集本院2008年-2016年间249例肺癌患者癌组织标本,免疫组化法检测A3B的表达,根据其表达高低程度评分,并分析A3B表达高低与不同临床资料及预后之间的统计学关系。结果:1.q-PCR及Western blot结果显示,相比正常肺上皮细胞,H1975,A549等非小细胞肺癌细胞的A3B表达量明显增高,仅有HCC827肺癌细胞中A3B表达量相对较低。2.本实验室通过极限稀释法获得HCC827单克隆起源细胞HCC827/B3,经细胞STR鉴定,遗传学与亲本细胞一致。通过Cas9-SAM技术成功构建A3B过表达肺癌细胞系B3/A3B及对照细胞B3/control,A3B在B3/A3B细胞中m RNA表达较对照组相对提高20余倍,同样,在蛋白水平上的表达较对照组显著增高。3.AP assay通过检测B3/A3B细胞AP位点较B3/con增多,p<0.001,差异具有统计学意义,间接代表了过表达A3B后细胞脱氨酶活性增强。4.细胞过表达A3B后,与对照细胞相比侵袭能力明显增加,p<0.0001;转移能力明显增加,p=0.0001。划痕实验显示B3/A3B细胞迁移速度加快。裸鼠肺癌转移模型中,注射B3/A3B细胞小鼠较对照组出现肺部肿瘤结节增多增大,进一步HE染色可见结构紊乱的癌组织。5.过表达A3B细胞B3/A3B经P53第5-8号外显子测序鉴定,A3B高表达的细胞系出现多个位点突变T(c.521A>G;p.R174W),T(c.573C>T;p.P191V),T(c.885C>T;p.P295V)等的错义突变,74例肺癌病理组织标本中组织亦存在P53高突变率(27/74)且存在如下热点突变:T(c.767C>G;p.T256R),T(c.722C>T;p.S241F),T(c.817C>T;p.R273C),T(c.722C>T;p.S241F),T(c.742C>T;p.R248W),T(c.859G>A;p.E287K)。74例肺癌病理组织的免疫组化实验中,p53突变型的病例A3B总体表达较p53野生型病例明显增高,p<0.05。6.B3/A3B干扰p53表达后,细胞划痕48小时伤口愈合百分比16.21±10.19,比较干扰对照细胞48小时伤口愈合百分比66.95±4.82,p=0.0108,差异具有统计学意义,干扰p53表达后迁移速度减慢。Transwell小室侵袭实验干扰组与对照组侵袭至下室细胞个数分别为198.7±9.493,396±19.97,p<0.0001,提示干扰p53能部分逆转B3/A3B侵袭转移潜能。同样,在p53缺失细胞H1299过表达A3B后,细胞侵袭转移能力未见差异性增高。最后,p53及其下游转移相关因子蛋白印迹检测发现,B3/A3B转移相关因子如Slug,MMP2,MMP9水平明显增高,而在干扰p53之后,上述蛋白表达相对下调。7.249例肺癌及42例正常肺组织的免疫组化结果显示:A3B在肺癌病人组织较正常人肺组织表达升高,p<0.005,差异具有统计学意义;A3B表达与患者临床病理资料统计分析结果显示,A3B高表达与淋巴结转移及不良预后具有正相关关系,与年龄、性别、肿瘤类型等资料不存在统计学相关性。结论:1.A3B具有促进肺癌侵袭转移的作用。2.A3B可能通过促进p53基因突变介导肺癌转移。3.A3B可作为判断肺癌预后的标志性分子。