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原花色素(Proanthocyanidins)是植物中常见的一大类具有C6-C3-C6基本结构的聚多酚类物质,具有抗氧化、抗菌、抗炎症、抗癌以及预防和治疗心脑血管疾病、二型糖尿病等众多生物活性。南酸枣(Choerospondias axillaris),又名广枣,其干燥成熟果实是蒙药的习用药材,用于治疗心肌缺血、心律失常等心脑血管疾病;南酸枣鲜果味酸、涩,不耐储藏,目前对南酸枣的开发利用侧重于对鲜果果实的加工,在加工过程中会产生大量富含生物活性物质的枣皮副产物,这些副产物常作为废弃物被丢弃,因此不仅造成资源的浪费,还对环境造成污染。 为了深入了解南酸枣皮的利用价值,本研究首先以南酸枣皮和枣肉为原料,采用超声辅助提取、大孔吸附树脂纯化等方法提取、纯化南酸枣皮和枣肉酚类化合物,采用UPLC、UPLC-QTOF-MS2等方法对比分析枣皮及枣肉提取物中酚类化合物的含量和种类;同时测定两种提取物抗氧化、抗菌及抗癌细胞增殖活性;进一步采用大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离纯化南酸枣皮原花色素提取物,采用光谱分析、酸催化降解、UPLC、UPLC-QTOF-MS等方法分析原花色素的结构组成;同时利用葡聚糖凝胶LH-20层析柱将南酸枣皮原花色素提取物分级纯化成具有不同平均聚合度的组分,测定各原花色素组分对碳水化合物水解酶的抑制活性、抗氧化活性、抗癌细胞增殖活性;研究南酸枣皮原花色素提取物在体内外的抗血管生成能力。主要研究结果如下: 1.南酸枣皮提取物中总酚含量显著高于枣肉提取物,两种提取物主要酚类化合物均是儿茶素(Catechin)和低聚原花青素(Oligomeric Procyanidine);此外,两种提取物都具有优秀的铁离子还原能力(FRAP)、DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力,并呈剂量依赖关系;南酸枣皮提取物对所选食源性致病菌的抑菌活性高于枣肉提取物;两种提取物对肝癌细胞(HepG2)和结肠癌细胞(Caco-2)的抗增殖作用都随样品作用剂量和作用时间的增加而增强。 2.进一步研究南酸枣皮中原花色素的结构组成,结果显示南酸枣皮原花色素主要为原花青素型,延伸单元为表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate)、表儿茶素(Epicatechin)和儿茶素(Catechin),此外还含有少量的表棓儿茶素(Epigallocatechin);末端单元主要由儿茶素组成;各组成单元间通过B型键连接;大部分原花色素组分表现出很强的α-淀粉酶和α-葡糖苷酶抑制活性,并呈剂量依赖关系;南酸枣皮原花色素对α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的抑制作用随其平均聚合度和棓酸酯化度的增加而增强。 3.在体外化学抗氧化测定模型(DPPH、ABTS、FRAP和磷钼酸法)中,各原花色素组分都表现出很强的抗氧化活性,但原花色素组分的抗氧化活性与其平均聚合度间的相关性差;利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立细胞内抗氧化模型,原花色素组分的细胞内抗氧化活性随其平均聚合度的增加而减小。 4.利用CCK-8法,测定不同平均聚合度原花色素组分对结肠癌细胞(Caco-2)的抗增殖活性,结果显示原花色素组分对Caco-2细胞的抗增殖活性随其平均聚合度的增加而增强,平均聚合度最高的组分具有最强的抗癌细胞增殖能力;流式细胞术检测结果显示南酸枣皮原花色素可以诱导结肠癌细胞发生凋亡,并且随着原花色素组分平均聚合度的增加其诱导癌细胞凋亡的能力随之增强;原花色素诱导结肠癌细胞的凋亡既通过胞内线粒体途径又通过胞外死亡受体途径。 5.利用体外细胞模型和体内转基因斑马鱼模型评估南酸枣皮原花色素提取物的抗血管生成能力。实验结果显示南酸枣皮原花色素提取物在0-200μg/mL浓度范围内对HUVEC没有细胞毒性,但可以显著抑制HUVEC的迁移和成管能力,并呈剂量依赖关系;南酸枣皮原花色素可以有效调节内皮细胞中Akt、ERK和p38MAPK蛋白的磷酸化水平;此外,南酸枣皮原花色素提取物可以显著抑制斑马鱼肠下静脉血管的生成,并呈剂量依赖关系。