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流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染疾病,传播迅速且极易造成大规模爆发与流行,而接种疫苗是预防流感病毒传播的主要措施。近年来随着全球流感防控能力建设的加快以及对流感疫苗产品质量需求的提高,国外已有基于不同类型细胞基质的流感疫苗相继获批上市,而国内的流感疫苗还仍然完全依赖于鸡胚进行生产,目前MDCK细胞基质流感疫苗是国内疫苗研发的主要方向,但在细胞基质流感疫苗研发中有关病毒感染细胞机制的研究较少。本研究以MDCK细胞与H3N2型流感病毒株(NYMCX-223A)为研究对象,应用蛋白质组学、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分析筛选出了MDCK细胞在感染H3N2型流感病毒株过程中的差异表达蛋白,为深入了解MDCK细胞与A型流感病毒的互作机制奠定了基础,获得以下研究结果:1.通过iTRAQ定量蛋白质组学测定未感染和以MOI=1的H3N2型流感病毒感染12h的MDCK细胞中的蛋白质,共鉴定出374种差异表达蛋白质,其中表达量上调的差异表达蛋白质有51种,表达量下调的差异表达蛋白质有323种。2.通过对iTRAQ定量蛋白质组学数据进行统计学、GO富集与KEGG富集分析,筛选出四种参与A型流感病毒感染相关的差异表达蛋白质,分别是糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3B)、S-腺苷甲硫氨酸基区域蛋白2(sadical S-adenosyl methionine domain containing 2,RSAD2)、电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)和丝裂原激活蛋白激酶激酶2(mitogen activated protein kinase kinase 2,MAP2K2,MEK2),其中RSAD2与VDAC1表达量上调,GSK3B与MEK2表达量下调。经实时荧光定量PCR验证表明在感染12h时,RSAD2的mRNA表达水平显著降低(p<0.05),GSK3B、VDAC1和MEK2的mRNA表达水平均为极显著降低(p<0.01),GSK3B和MEK2与蛋白组学分析中的结果趋势一致,而RSAD2和VDAC1与蛋白组学分析中蛋白表达趋势相反,需要进一步研究。3.H3N2型流感病毒感染MDCK细胞可激活ERK信号通路,而MEK2蛋白表达水平随着感染时间的延长逐渐显著降低,其磷酸化水平随着感染时间的延长逐渐显著升高,推测H3N2型流感病毒感染MDCK细胞可能是通过MEK2-ERKs级联激活方式使ERK信号通路活化。本研究确定了以MOI=1的H3N2型流感病毒感染MDCK细胞12h进行应答蛋白的筛选,运用iTRAQ定量蛋白组学筛选出感染过程中的差异表达蛋白,通过统计学、GO富集、KEGG信号通路分析及实时荧光定量PCR进一步筛选出MEK2蛋白为H3N2型流感病毒感染MDCK细胞的应答蛋白,通过蛋白质免疫印迹检测MEK2蛋白在感染过程中蛋白量及磷酸化水平的变化,结果表明MEK2蛋白磷酸化水平的升高或许是H3N2型流感病毒感染MDCK细胞激活ERK信号通路的分子机制,为进一步研究ERK信号通路调控H3N2型流感病毒在MDCK细胞中的复制增殖的作用提供了重要实验依据。