目的：　　自噬是从真核生物到人都高度保守的一种细胞自我消耗的途径。在饥饿条件下，细胞通过自噬途径降解自身蛋白和细胞器得到核苷酸、氨基酸、脂肪酸、糖类和ATP，以维持细胞代谢的正常进行而得以在恶劣环境下继续存活，自噬还能清除细胞内错误折叠的蛋白和破损的细胞器，维持胞内蛋白和细胞器处于正常水平。自噬的适时发生和适当的自噬水平是机体正常运作的一大保证。自噬异常与炎症、肿瘤和神经退行性疾病等多种疾病有关，目前靶向自噬的药物3-甲基腺嘌呤和氯喹都已经被用于肿瘤的治疗，对自噬的深入了解能够辅助医疗，指导药物的开发和临床用药，促进新的治疗策略的产生。　　自噬流的主要检测指标包括pro-LC3向LC3-I的转化、LC3-I向LC3-II的转化，P62在自噬溶酶体中的降解。自噬促进时，pro-LC3的切割增加，LC3-I的脂化增加，P62的降解增加。自噬事件包括自噬的起始、成核、自噬前体膜的延长、自噬体的成熟、自噬体与溶酶体的融合、吞噬物的降解再利用。自噬前体膜的延长涉及到pro-LC3在半胱氨酸酶Atg4B的作用下被切割掉C末端的5个氨基酸（MKLSV）变成LC3-I，LC3-I经Atg7、Atg3、Atg10、Atg12-Atg5-Atg16L的共同作用被脂化形成磷脂酰乙醇胺（PE，Phosphatidylethanolamine）修饰形式的LC3-II，并特异性定位于自噬前体膜上，这为自噬体的成熟创造条件。　　但这一切割和脂化过程被如何抑制还不清楚，因此本研究拟探讨本实验室发现的GA6癌蛋白在这一切割和脂化过程中的作用及GA6对自噬的影响。　　内容：　　本研究的研究内容主要包括如下：　　1）探讨GA6是否与自噬有关。筛选与GA6有相互作用的蛋白，并进行验证。　　2）GA6对自噬有什么影响。GA6是促进自噬还是抑制自噬，有哪些表现可以证明。　　3）GA6对LC3切割的影响。GA6对LC3的切割有什么影响，具体影响机制是什么。　　4）GA6对LC3-I脂化的影响。GA6对LC3-I的脂化有什么影响，该影响是否因为LC3-I的形成变化引起。　　5）GA6对自噬的影响在C57小鼠上有什么表型。结合(60)Co照射，分析GA6、自噬与放射敏感性的关系。　　方法：　　利用CRISPR/Cas9技术构建了GA6-/-的乳腺癌细胞亚株ZR75-1和GA6-/- C57小鼠，并确定了能够有效敲低GA6的siRNA，建立了敲低GA6的宫颈癌细胞亚株Hela。　　利用免疫共沉淀结合质谱法和快速蛋白液相色谱法筛选与GA6有关的自噬蛋白，并与GA6进行Co-IP，进一步判断其是否与GA6具有相互作用，接着我们用GST pull-down实验最终确定具体是哪个自噬蛋白与GA6有直接相互作用，并确定此自噬蛋白为本研究的中心。　　应用免疫荧光技术观察点状 LC3的形成情况，应用透射电子显微镜技术观察自噬体和自噬溶酶体的形成情况，应用Western blot技术检测LC3-I向LC3-II的转化情况。通过氯喹和雷帕霉素的处理，探究GA6对自噬的影响具体表现在哪个自噬环节，又是否通过mTOR通路。　　为探讨GA6对LC3的切割和脂化的影响，我们构建了Myc-LC3-PLA2的重组质粒，在体内研究GA6是否影响LC3的切割；构建了GST-LC3-GFP的重组质粒，通过观察GFP荧光的强弱来体外研究GA6是否影响LC3的切割；通过GST pull-down实验探讨GA6、LC3、Atg4B三者之间的定位关系，明确GA6影响LC3的切割的具体机制。为了研究脂化，我们构建了GFP-LC3-Hela的稳定细胞亚株，体内通过流式细胞术检测GFP的平均荧光强度（MFI，Median Fluorescent intensities）来反映LC3-II的形成情况；体外通过LC3-I与PE beads的结合情况来反映GA6对LC3-I的脂化的影响。　　在动物水平方面，我们将野生型小鼠分为正常饲养组和自噬诱导组，分别进行1000 cGy剂量的(60)Co照射，统计生存曲线来研究自噬对小鼠放射敏感性的影响；将GA+/+组和GA6-/-组小鼠分别进行1000 cGy剂量的(60)Co照射，统计生存曲线来研究GA6对小鼠放射敏感性的影响。　　结果：　　（1）LC3与GA6有直接相互作用。通过免疫共沉淀结合质谱法、快速蛋白液相色谱法和免疫共沉淀法检测到GA6与LC3有相互作用，通过GST pull-down确定LC3与GA6有直接相互作用，因此将研究中心定为LC3。　　（2）GA6抑制自噬。免疫荧光显示GA6敲低或者敲除均导致细胞质中点状LC3的形成增加，Western blot显示GA6抑制LC3向LC3-II的转化，透射电子显微镜显示GA6抑制自噬体的形成。因为磷酸氯喹（CQD，Chloroquine Diphosphate Salt）处理后GA6对自噬的抑制作用更明显，所以我们判断 GA6对自噬的抑制出现在自噬体与溶酶体融合之前，也就是自噬前体延长成自噬体的过程。并通过雷帕霉素的处理发现 GA6抑制自噬不依赖于mTOR通路。　　（3）GA6抑制Atg4B对LC3的切割。体内实验表明，当GA6过表达时，LC3-PLA2的切割减少；体外实验表明，Atg4B单独存在时，GST-LC3-GFP的绿色荧光变为无色，说明Atg4B可切割LC3；GA6、Atg4B同时存在时，GST-LC3-GFP的绿色荧光变化不大，表明GA6抑制Atg4B对LC3的切割。又因为GA6、Atg4B定位于LC3的同一片段，表明GA6与Atg4B竞争性结合于LC3而导致GA6抑制Atg4B对LC3的切割。　　（4）GA6抑制LC3-I的脂化。体内实验表明，当GA6过表达时，MFI of GFP-LC3-II减少；体外实验表明，当有GA6存在时，结合在PE beads上的LC3-I减少。　　（5）小鼠诱导自噬后表现为放射抵抗，GA6-/-小鼠表现为放射敏感。当野生型正常饲养组和自噬诱导组小鼠经过相同剂量的(60)Co照射后，生存曲线分析显示，与正常饲养组相比，自噬诱导组小鼠死亡更慢；当 GA6+/+与 GA6-/-小鼠经过相同剂量的(60)Co照射后，生存曲线分析显示，与GA6+/+小鼠相比，GA6-/-小鼠死亡更快。　　结论：　　发现了一个新的抑制自噬的分子—GA6。GA6通过与Atg4B竞争性结合于LC3抑制Atg4B对pro-LC3的切割，从而抑制LC3-I的形成，GA6还抑制LC3-I的脂化。GA6由于抑制pro-LC3的切割和LC3-I的脂化导致自噬前体延长障碍，从而抑制自噬。