目的:黄酮类化合物是植物在生长过程中产生的一类次级代谢产物。国内外大量研究表明,黄酮类化合物具有显著的抗炎、抗动脉粥样硬化、降血糖等,特别是抗氧化作用。黄酮类化合物的许多药理、生理活性均与自由基的清除能力有关,而自由基是很多疾病产生和恶化的重要因素。壮族常用药物国虾薄(壮语“Gocaekmbaw”),又名绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)为葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属植物,具有清热解毒,止咳祛痰功能。研究文献报道发现,对国虾薄的成分和药理活性的研究多集中在皂苷类,黄酮类研究较少。本研究拟通过一系列色谱、波谱方法分离、鉴定国虾薄黄酮类化合物;利用UPLC-MS等方法分析国虾薄黄酮化合物的含量;建立过氧化氢损伤人肺腺癌细胞A549、小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,结合DPPH自由基模型,评价国虾薄黄酮的体外抗氧化活性和机制;建立脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导SD大鼠急性肺损伤模型,探讨国虾薄黄酮体内抗氧化活性及机制。方法:1.利用70%乙醇超声提取国虾薄,运用硅胶色谱、中压快速制备反相色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱、半制备型高效液相色谱等方法,对国虾薄黄酮成分进行进一步的分离、纯化,并通过UV、MS、NMR等波谱学分析手段,结合文献资料,对其进行结构鉴定。2.以本课题分离到的化合物为标准品,根据待测样品保留时间和化合物种类选择内标化合物,利用UPLC-MS,建立最佳色谱、质谱条件,测定国虾薄中主要黄酮化合物的含量,并评价方法的线性范围、检测限、稳定性、精密度,以及重复性,分析国虾薄黄酮化合物的含量。3.采用DPPH清除模型评价国虾薄黄酮的体外抗氧化活性。建立H2O2诱导人肺腺癌细胞A549、小鼠巨噬细胞RAW264.7氧化损伤模型,采用不同浓度国虾薄黄酮修复10h后,运用MTT法筛选修复氧化损伤活力最高的国虾薄黄酮。DCFH-DA荧光探针法测定细胞内ROS的水平,TBA比色法测定细胞内MDA的含量,NBT法测定细胞内SOD的活力,DTNB法测定GSH的含量,WestemBlot法检测细胞内Nrf2、HO-1、MQO1的表达水平。4.SPF级SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、国虾薄黄酮低剂量组、国虾薄黄酮中剂量组、国虾薄黄酮高剂量组,建立LPS气管滴注法诱导SD大鼠急性肺损伤模型,HE染色观察各组大鼠肺损伤情况,分别用台盼蓝染色计数分析BALF炎症细胞、瑞士-吉姆萨染色观察BALF炎症细胞情况,BCA法测定BALF蛋白含量,计算肺通透指数。分别采用TBA、NBT、DTNB比色法测定各组大鼠血清、肺组织内MDA、SOD、GSH的含量及活力。ELISA检测各组大鼠血清、肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α及TGF-β1表达情况,Western Blot法检测其中Keap 1、NQO1、HO-1的表达水平。LCMS-IT-TOF检测国虾薄黄酮灌胃SD大鼠后代谢物,分析国虾薄黄酮的吸收、代谢情况。结果:1.从国虾薄中分离得到的12个黄酮类化合物,外观为黄色无定型粉末,通过分析LCMS-IT-TOF的UV图谱及MS数据,初步确定化合物属于黄酮醇类。根据13CNMR数据,结合文献,可以确定化合物1为芦丁(1),化合物2为4’-O-甲基-山奈酚-3-O-芸香糖(2),化合物3为商陆苷(3),化合物4为山奈酚-3-β-D-O-芸香糖(4),异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖(5),化合物6为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6),化合物7为异鼠李素(7),化合物8为山奈酚(8),化合物9为槲皮素.(9)。因化合物10结构不稳定,化合物11和化合物12的含量较低,根据其LCMS-IT-TOF数据等,初步推测化合物10为异鼠李素-3-0-(4"’-O-乙酰基)-β-D-芸香糖苷(10),化合物11为甲基-山奈酚(11),化合物12为二甲基-槲皮素(12)。其中,4’-O-甲基-山奈酚-3-0-芸香糖(2)是首次在绞股蓝属中发现。2.以异橙皮苷作为内标化合物,利用UPLC-MS进行分析,测定国虾薄中化合物1、2、3、4、5、6、10,内标化合物及7个成分间分离效果良好,供试品溶液中被测成分与对照品的保留时间相同,色谱图及其母离子、子离子质谱图基本一致,表明本法专属性良好。连续进样6次,7种成分的RSD值,结果均低于2%,表明仪器精密度良好。分别间隔2小时和3天进样,7种成分的RSD值均小于5%,表明仪器稳定性良好。连续进样6次,RSD均低于5%,表明仪器重复性较好,每组做三个重复,测得国虾薄中黄酮化合物的含量在 57.11-12907.74 μg/g。3.国虾薄黄酮单体中,槲皮素(9)清除DPPH能力最强,IC50达到3.11±0.07μg/mL,其次是槲皮素-3-O-葡萄糖苷(6),IC50为 5.74±0.08μg/mL,山奈酚-3-O-芸香糖苷(4)的DPPH清除能力最低,IC50值为443.65±3.46μg/mL。通过分析构效关系得出,化合物3-C及3’-C位置的羟基对化合物抗氧化能力起关键作用,相应位置羟基的减少会导致清除DPPH能力的降低。分别采用500μmol/L、300μmol/LH2O2刺激人肺腺癌A549细胞、小鼠巨噬细胞RAW 264.7作用10 h建立氧化损伤模型,存活率分别为60.4%、66.2%。采用国虾薄黄酮50μg/mL修复10h后,槲皮素(9)的修复能力最强分别为83.1%及80.3%,结合化合物含量,选择芦丁(1),4’-O-甲基-山奈酚-3-O-.芸香糖(2),异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖(5),槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6)进行后续研究。经H2O2损伤造模后,A549细胞、RAW264.7细胞内ROS、MDA含量显著升高(p<0.05),SOD、GSH含量均显著下降(p<0.05)。经国虾薄黄酮化合物修复后,细胞内ROS、MDA含量下降,化合物9修复A549细胞后,MDA含量最低至1.44土0.25μmol/mg prot。国虾薄黄酮处理组后A549细胞、RAW264.7细胞内SOD活力、GSH含量均明显上升(p<0.05)。Western blot检测A549细胞内相关蛋白含量与未处理组比较,H2O2刺激后Nrf2、NQO1呈明显表达,国虾薄黄酮处理可进一步刺激Nrf2及NQO-1的产生。H2O2刺激后,模型组HO-1表达呈现减少趋势,药物处理后各组HO-1蛋白表达均有上调。与未处理组比较,H2O2刺激后RAW264.7细胞后Nrf2表达显著升高,但引起了 NQO1、HO-1表达的下降,经国虾薄黄酮处理后Nrf2的表达进一步提高,同时NQO1、HO-1表达均有提高,达到正常组细胞水平。4.LPS气管滴注SD大鼠后,模型组大鼠平均体重显著低于空白组大鼠的体重(p<0.05),且肺系数显著高于空白组(p<0.05)。灌胃地塞米松的阳性对照组大鼠肺系数与空白组相比没有统计学差异,但是体重最低,且与空白组相比具有显著统计学差异(p<0.01)。灌胃国虾薄总黄酮组大鼠体重、肺系数与空白组相比,均没有统计学差异。与空白组大鼠血清比较,模型组的大鼠血清中O2-、MDA浓度均有增加,其中MDA含量差异具有显著统计学意义(p<0.01),O2-含量没有统计学差异。阳性对照组、中剂量组以及高剂量组的大鼠血清与模型组比较,MDA含量显著降低(p<0.01)。模型组大鼠血清的SOD活力、GSH含量降低,且具有统计学差异(p<0.05),国虾薄黄酮给药组大鼠血清中SOD活力与模型组相比均有显著上升(p<0.01)。与空白组大鼠肺组织中O2-、MDA含量比较,模型组均有升高,且差异有统计学意义(p<0.05)。给药干预后,与模型组比较,MDA含量都表现出显著的统计学差异(p<0.01)。与空白组大鼠肺组织中SOD活力相比,模型组显著降低(p<0.01),且阳性对照组的SOD活力最低,而国虾薄黄酮给药后可显著提高大鼠肺组织SOD的含量(p<0.01)。与空白组相比,模型组、阳性对照组GSH含量都呈下降趋势,且具有统计学差异(p<0.05),中剂量组与高剂量组中GSH含量都有上升,但仍低于空白组,与模型组没有统计学差异。与空白组比较,模型组大鼠的血清中炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β1蛋白水平显著提高(p<0.01),国虾薄总黄酮组的血清中IL-6、IL-10和TGF-β1的表达水平随着给药剂量的增加逐渐下降,且具有统计学差异(p<0.05)。与模型组相比,阳性对照组大鼠肺组织中TNF-α、TGF-β1、IL-10和IL-6的浓度显著降低(p<0.01),国虾薄黄酮高剂量组TNF-α、TGF-β1、IL-10和IL-6的浓度也呈下降趋势,并具有统计学差异(p<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠的血清、组织中Keap1、NQO1及HO-1的表达蛋白水平升高,其中Keap1显著升高(p<0.05)。国虾薄黄酮处理可降低血清中Keap-1、NQO 1的表达,且与空白组相比不具有显著性差异,而地塞米松阳性对照组Keap-1仍具有显著差异(p<0.05)。经国虾薄黄酮处理后肺组织中NQO 1及HO-1的表达进一步提高,同时Keap 1表达降低,与正常组相比也不具有统计学差异。结论:1.国虾薄中含有丰富的黄酮,从国虾薄中共分离得到黄酮类化合物12个,其中结构鉴定9个,化合物2为首次在绞股蓝属中发现。利用UPLC-MS可快速、准确测定国虾薄中主要黄酮化合物的含量。2.国虾薄黄酮能够降低H2O2氧化损伤细胞内ROS、MDA的含量,提高SOD、GSH表达水平,刺激Nrf2因子的表达,同时激活下游NQO1、HO-1等抗氧化因子,从而减轻细胞因自由基过多造成的损伤,提高细胞存活率,减轻组织受到的氧化损伤。3.国虾薄黄酮可被SD大鼠吸收、代谢,减轻LPS损伤导致的急性肺损伤,降低肺指数,降低受肺损伤大鼠血清及肺组织中O2-、MDA的含量,提高SOD的活力以及GSH的含量,降低IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1等炎症因子的表达水平,调控Keap1、NQO1及HO-1的表达来抵抗氧化应激反应,来抵抗氧化应激反应,减轻大鼠肺损伤程度。