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第一部分:LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型构建及其支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平研究研究背景:急性肺损伤(ALI)/急性呼吸系统窘迫综合征(ARDS)是一种严重的呼吸障碍性疾病,其通过剧烈且失控的系统性炎症反应直接或间接导致肺损伤。其中,肺泡巨噬细胞在ALI/ARDS的炎症反应中发挥了重要作用。LPS诱导的动物模型能够通过吸入或系统性暴露于LPS短时间内重现肺组织上皮和内皮屏障的急性损伤以及肺泡内的急性炎症反应,因此,其是模拟及研究人ALI/ARDS病理机制的理想模型。研究目的:探究LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型中炎症因子的水平变化研究方法:1.利用腹腔注射法构建LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型。2.通过检测大鼠肺组织湿干重比(wet/dryratio)、支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度以及炎症细胞数量评估肺损伤程度。3.通过HE染色法检测大鼠肺组织的病理学变化。4.通过酶联免疫法(ELISA)检测BALF或细胞培养基中炎症因子水平。5.利用流式细胞法分离BALF中的巨噬细胞。6.利用荧光定量PCR法(qPCR)检测从BALF中分离的巨噬细胞内IL-33 mRNA水平。7.利用免疫印迹法(Western blot)检测肺泡巨噬细胞内ST2和IL-1RAP蛋白水平。研究结果:1.LPS处理的大鼠肺组织湿干重比(wet/dry ratio)、BALF蛋白浓度以及BALF中总细胞和巨噬细胞数量明显升高。2.经LPS处理的大鼠肺组织内存在肺泡壁增厚、肺泡萎陷以及炎症细胞浸润等病理学变化。3.LPS诱导的急性肺损伤大鼠BALF 中 IL-33、TNF-α、MMP-2、MMP-9 和 TIMP1 的含量显著升高。4.从 LPS 诱导的急性肺损伤大鼠BALF中分离得到的巨噬细胞中IL-33 mRNA水平上调。作为IL-33受体分子,ST-2蛋白水平明显上调,而IL-1RAP没有显著变化。5.经LPS处理的原代肺泡巨噬细胞的培养基上清中IL-33、TNF-α、MMP-2和MMP-9的含量显著升高。6.LPS处理后原代巨噬细胞中ST-2表达上调,而IL-1RAP没有显著变化。7.LPS 处理后 NR8383 细胞分泌的 IL-33、TNF-α、MMP-2、MMP-9 和 TIMP1 的浓度明显升高。其中,TNF-α、MMP-2、MMP-9和TIMP1的上调具有时间依赖性,而IL-33的分泌在LPS处理12小时后达到最高,随后下降。结论:LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型中肺泡巨噬细胞促进了多种炎症因子的分泌。第二部分:IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中的作用机制研究研究背景:作为促炎症因子,IL-33在先天性免疫、过敏性炎症以及组织损伤过程中发挥重要作用。在患有哮喘、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化以及风湿性关节炎的病人血清或组织中IL-33水平升高。我们的前期研究也发现,急性肺损伤患者血清IL-33水平显著高于正常人,提示IL-33和ALI/ARDS之间存在潜在关联。STAT3属于胞内信号传导分子,其可以被各种胞外刺激因子激活,从而在炎症反应中发挥重要的信号转导作用。作为基质金属蛋白酶家族成员,MMP-2和MMP-9的高表达被认为促进了肺组织的急性损伤。研究目的:探究炎症因子IL-33在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中的作用机制研究方法:1.通过酶联免疫法(ELISA)检测肺泡巨噬细胞NR8383培养基中炎症因子水平。2.利用免疫印迹法(Western blot)检测NR8383细胞内相应基因蛋白水平。3.利用荧光定量PCR法(qPCR)检测NR8383细胞内相应基因mRNA水平。研究结果:1.IL-33诱导NR8383细胞表达并分泌MMP-2和MMP-9。2.利用p-STAT3抑制剂或靶向STAT3的siRNA阻断STAT3信号抑制了 IL-33诱导的MMP-2和MMP-9的表达和分泌。3.利用特异性抗体中和培养基中的IL-33抑制了 LPS诱导的MMP-2和MMP-9分泌。结论:IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中发挥了重要作用。第三部分:IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究研究背景:IL-33表达的改变已经在临床前急性肺损伤动物模型中被广泛讨论。在呼吸机诱导的肺损伤模型中,大鼠肺内IL-33水平显著升高。IL-33能够促进外周血单核细胞、肺泡内皮细胞以及上皮细胞分泌IL-8和IL-6,从而诱导中性粒细胞进入肺泡中。除了调控细胞因子的表达,IL-33也能够增加肺泡内皮屏障的通透性以及诱导肺泡上皮细胞的死亡。这些IL-33带来的影响都直接促进了肺损伤的发展。研究目的:体内验证IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究方法:1.通过检测大鼠肺组织湿干重比(wet/dry ratio)、支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度以及炎症细胞数量评估肺损伤程度。2.通过酶联免疫法(ELISA)检测BALF中MMP-2和MMP-9水平。3.通过HE染色法检测大鼠肺组织的病理学变化。4.通过免疫组化法检测大鼠肺组织中p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平。研究结果:1.IL-33抗体抑制了 LPS诱导的大鼠肺组织湿干重比(wet/dry ratiO)、BALF蛋白浓度以及BALF中总细胞和巨噬细胞数量的升高。2.IL-33抗体显著降低了 LPS诱导的急性肺损伤大鼠BALF中MMP-2和MMP-9的浓度。3.LPS处理后大鼠肺组织发生了明显的病理学变化(肺泡壁增厚、肺泡萎陷以及炎症细胞浸润),同时其p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平升高。而IL-33抗体的加入在一定程度上逆转了 LPS诱导的肺组织形态学改变,同时降低了 p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平。结论:IL-33抗体能够降低LPS诱导的急性肺损伤程度,同时抑制MMP-2和MMP-9的分泌。