目的黄体酮(又称孕酮)是一种类固醇激素,可以在雌性动物的卵巢和胎盘合成,常用于妇产科学。近几年研究表明,神经系统也可以生成黄体酮,如神经胶质细胞,主要是少突胶质和星形胶质。且有研究表明,在神经系统中,黄体酮通过调节基因的转录、细胞内的信号通路和神经传导而发挥了多效性。近年来有少量文献报道,黄体酮可以减轻CCI(Chronic constrictive injury)诱导的疼痛行为,并且可以修复外周的运动及感觉神经纤维上电生理的变化,提示黄体酮对于神经痛具有治疗作用,但其具体机制并不清楚。本实验拟用L5脊神经结扎(Spinal Nerve Ligation,SNL)造成的神经病理性疼痛模型大鼠,应用行为学和免疫荧光染色法分别检测孕酮对疼痛行为的影响及对小胶质细胞和星形胶质细胞活化的影响,并用ELISA蛋白测定方法对腰骶膨大处脊髓和L5神经节中COX-2(Cyclooxygenase-2)和i NOS(inducible nitric oxide synthase)蛋白表达的影响,以探讨黄体酮的镇痛机制。方法实验一:建造脊神经结扎模型。术后第3天开始测量大鼠术侧和对侧的机械缩足阈值,直到术后第21天,以检测大鼠疼痛阈值的经时变化过程。取无痛觉过敏和痛觉迟钝的正常雄性Sprague-Dawley大鼠24只,将其随机的分为三组:正常组、假手术组和手术组。用von Frey细丝测定实验大鼠机械缩足阈值,以50%的缩足阈值(50%paw withdrawal threshold,50%PWT)表示,绘制模型大鼠的时间-疼痛行为变化曲线。实验二:黄体酮对大鼠机械缩足阈值的影响。取健康成年雄性SD大鼠32只,随机分为4组:正常组、空白对照组和黄体酮低剂量(8 mg/kg)及高剂量组(16mg/kg)。正常组大鼠不做任何处理;空白对照组大鼠于SNL手术当天开始,皮下注射助溶剂即22.5%环糊精溶液(注射容积:3ml/kg体重),正常组亦皮下注射22.5%环糊精溶液,每天一次,连续21天;实验组大鼠分别皮下注射低剂量(8 mg/kg/d)和高剂量(16mg/kg/d)的黄体酮。各组大鼠分别于SNL术前6天开始测量,运用von Frey细丝检测大鼠后足的机械缩足阈值,每天测定一次,直到术后的第21天。升降法测定大鼠50%机械性收缩阈值。实验三:黄体酮对大鼠胶质细胞激活的影响。分别于给药后3天、7天、14天及21天,行为学测定后灌流,取脊髓腰骶膨大处,做冰冻切片,对星胶质细胞的标志物GFAP(glial fibrillary acidic protein)以及小胶质细胞的标志物OX-42进行免疫染色,在共聚焦显微镜下观察其表达变化。实验四:黄体酮对大鼠腰骶膨大处脊髓和L5神经节内COX-2和i NOS蛋白表达的影响。取健康成年雄性SD大鼠24只,随机分为3组:正常组、空白对照组及黄体酮组(16 mg/kg)。正常组大鼠不做任何处理;空白对照组大鼠于SNL术后开始,皮下注射助溶剂即22.5%环糊精溶液(注射容积:3ml/kg体重),每天一次,连续21天;实验组大鼠皮下注射高剂量(16mg/kg)的黄体酮,每天一次,连续21天;分别于3天、7天、14天及21天给药1h后灌流,取脊髓腰骶膨大处和术侧L5神经节,用ELISA试剂盒测定腰骶膨大处脊髓和L5神经节中COX-2和i NOS蛋白表达量。结果1.SNL脊神经结扎后机械性疼痛阈值经时变化曲线SNL术后第3天开始缩足阈值显著降低,此后缩足阈值基本维持在5g以下。SNL术后第14天开始,机械缩足阈值开始逐渐上升,直到第21天,但和假手术组相比,术侧机械缩足阈值依然很低(P<0.05),从SNL术后的第3天开始直到第13天,试验大鼠的缩足阈值维持在一个较稳定的水平(P<0.01)。2.SNL脊神经结扎后连续皮下注射黄体酮对机械缩足阈值的影响皮下注射黄体酮显著提高了术侧后足的机械缩足阈值。正常组、空白对照组、黄体酮低剂量组(8 mg/kg)和高剂量组(16 mg/kg)的术侧(左侧)机械缩足阈值术前分别是14.29±1.63g、14.41±1.01g、14.27±1.02g和14.49±0.95g;给药3天后分别为14.74±0.73、3.84±1.09g、4.47±0.96g和4.59±1.47g;给药7天后分别为14.49±0.95、3.47±1.78g、4.76±1.72g和5.41±0.76g;给药14天后分别为14.32±1.30、4.39±0.61g、5.48±0.54g和7.20±0.81g;给药21天后分别为14.33±0.93g、5.37±0.98g、8.55±1.10g、11.65±1.83g。结果表明,术后第14天和第21天,黄体酮高剂量组(16 mg/kg)、低剂量组(8 mg/kg)和空白对照组相比,机械缩足阈值显著增加(分别是P<0.05,P<0.01),且黄体酮高剂量组(16 mg/kg)和黄体酮低剂量组(8 mg/kg)对比,机械缩足阈值显著增加(P<0.01)。黄体酮对手术对侧的痛阈无显著影响。3.SNL脊神经结扎后连续皮下注射黄体酮对OX-42表达的影响免疫染色的结果表明,脊神经结扎后会使脊髓中的小胶质细胞活化。小胶质细胞激活后,由静息状态的分枝状分化成活化状态的阿米巴状。SNL术后小胶质细胞的标志物OX-42免疫染色强度经过统计分析后表明:正常组中OX-42的活化量很低,处于基线水平。与空白对照组相比,黄体酮组第3天的术侧光密度值及第7天的术侧光密度值(IOD)无统计学意义(P﹥0.05)。与空白对照组相比,黄体酮组第14天术侧光密度值(IOD)和第21天的术侧光密度值(IOD)具有统计学意义(均为P<0.01)。黄体酮抑制了SNL后小胶质细胞激活。4.SNL脊神经结扎后连续皮下注射黄体酮对GFAP表达的影响免疫染色的结果表明,脊神经结扎后使脊髓中的星胶质细胞活化。星胶质活化后,形态及数量会发生一定的改变,表现为增生、肥大,星胶质细胞的标志物GFAP免疫染色的强度在经过统计分析后表明,正常组中GFAP的表达量很低,位于基线水平。与空白对照组相比,黄体酮组第3天的术侧光密度值和第7天的术侧光密度值(IOD)无统计学意义(P﹥0.05)。与空白对照组相比,黄体酮组第14天术侧光密度值(IOD)和第21天的术侧光密度值(IOD)具有统计学意义(均为P<0.01)。黄体酮抑制了SNL后星胶质细胞激活。5.SNL脊神经结扎后连续皮下注射黄体酮对COX-2以及i NOS两种酶表达的影响。连续的皮下注射黄体酮显著的降低了脊髓背角和神经节中COX-2和i NOS两种蛋白的表达量。COX-2和i NOS蛋白在正常组大鼠的腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量很低,其平均含量分别为11.24±1.71ng/L、7.71±1.29 ng/L和0.80±0.09μmol/L、0.58±0.11μmol/L。SNL术后两种蛋白的浓度急剧升高,COX-2和i NOS蛋白在空白对照组中大鼠的腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的平均表达量分别为84.10±8.62 ng/L、88.85±6.91 ng/L和7.40±0.59μmol/L、7.58±0.60μmol/L。连续皮下注射黄体酮第3天和第7天,与空白对照组相比,COX-2和i NOS两种蛋白的表达量没有统计学意义(P﹥0.05)。黄体酮治疗组中,COX-2第3天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为84.59±9.23ng/L、87.56±8.26 ng/L,i NOS第3天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为7.45±0.87μmol/L、7.52±1.25μmol/L;COX-2第7天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为80.36±5.96 ng/L、85.29±8.41 ng/L,i NOS第7天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为7.14±0.47μmol/L、7.20±0.91μmol/L;与空白对照组对比,连续用药14天和21天后,两种蛋白表达量具有统计学意义(均为P<0.01)。黄体酮治疗组中,COX-2第14天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为58.84±5.44 ng/L、61.21±5.43 ng/L,i NOS第14天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为5.17±0.82μmol/L、5.23±0.58μmol/L;COX-2第21天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为32.77±5.07 ng/L、31.78±8.37 ng/L,i NOS第21天在腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中的表达量分别为2.42±0.29μmol/L、2.40±0.36μmol/L。结论黄体酮可剂量依赖性地抑制大鼠机械性疼痛行为,机制可能与抑制胶质细胞的激活以及降低了腰骶膨大处脊髓背角和L5神经节中COX-2和i NOS两种蛋白的表达有关。