研究目的基于三维共培养体系,将不同代数的猪关节软骨细胞（ACs）转染后与小鼠胚胎瘤细胞（ATDC5）包裹在水凝胶中以建立可有效释放生长因子的共培养体系,探索不同代数软骨细胞对生长因子释放的影响规律及共培养体系中ATDC5细胞的成软骨分化效果的影响。方法一、小鼠胚胎瘤细胞与猪软骨细胞的获取及、培养及传代小鼠胚胎瘤细胞购自美国圣地亚哥的百奇生物公司,置于含有ATDC5培养液的150cm2培养瓶中进行培养。采用酶解法从新鲜猪关节的软骨组织中获取猪软骨细胞,置于软骨培养液中培养至第一代（P1）、第三代（P3）、第五代（P5）以供实验使用。二、观察软骨细胞的形态学特征及检测软骨相关基因的表达情况在软骨细胞体外扩增培养过程中,应用倒置显微镜观察不同代数软骨细胞的形态学变化,实时定量PCR（q-PCR）检测软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）和聚集蛋白聚糖（ACAN）基因的表达水平。三、腺病毒转染软骨细胞及构建水凝胶三维共培养体系用携带转化生长因子β3（TGF-β3）基因的重组腺病毒分别转染P1、P3、P5软骨细胞,并在转染后第二天利用荧光显微镜观察病毒转染效果。随后分别取一定数量已转染的软骨细胞并与提前培养好的ATDC5细胞按照1:3的比例混合,离心弃上清后用海藻酸钠溶液重悬细胞混合物,在CaCl2溶液交联作用下将海藻酸钠/细胞混合液制作成凝胶微球,最后转移至含有软骨诱导液的24孔板进行28天的培养,并将这三组实验组分别命名为P1、P3、P5组。四、检测TGF-β3的释放情况及评估体外软骨分化效果。在规定的时间点收集共培养体系中的培养液,利用Elisa检测培养液中TGF-β3的浓度,并评估不同实验组之间TGF-β3的控释效果。在水凝胶中成软骨诱导过程的第28天,收集实验样本,并利用q-PCR评估相关成软骨特异性基因的表达,同时应用hematoxylin-eosin（HE）染色及免疫组化观察软骨标志蛋白的分泌情况;根据获得的数据,评估体外成软骨效果。结果一、本实验提取的新鲜原代软骨细胞在体外单层培养达到80%融合后传代至P1、P3、P5后使用。在此过程中,原代软骨细胞呈多角度形,传代之后的软骨细胞,细胞形态由多角形向梭形或类椭圆形变化;q-PCR检测软骨相关标志基因的结果显示,P1中的ACAN与ColⅡ基因表达相对较高,随着代数的增加,ACAN与ColⅡ基因表达下降,同时伴随着ColⅠ基因的表达上调,说明软骨细胞出现去分化现象。二、将携带TGF-β3基因的腺病毒感染P1、P3、P5软骨细胞,转染后第二天,利用荧光显微镜观察转染效率,可观察到三组细胞均有明显的荧光表达,转染效率均达到95%,其中P5组荧光强度最高,同时能观察到细胞生长状况良好。三、Elisa实验结果表明,P1、P3、P5三组实验组分泌TGF-β3的趋势是一样的,TGF-β3的分泌水平均在第3天到达最高点,其中峰值最高为P3组,峰值最低为P1组;然后在第6天出现明显的表达下降。在此后的共培养周期（第12天之后）,软骨细胞分泌的TGF-β3保持在一个较低的范围。q-PCR结果显示,P5组ATDC5细胞成软骨标志物基因（ACAN及ColⅡ）的表达水平高于P1、P3组,而ColⅠ基因在P3组的表达水平最低,P1组最高。而共培养体系中软骨细胞的ACAN及ColⅡ基因水平,P5组表达最低,而ColⅠ的表达水平却最高。HE染色结果显示各组切片样本中均有大量的细胞,成团生长,有软骨细胞的陷窝特征。番红O染色显示糖胺聚糖（GAG）的沉积情况,结果显示三组均有明显的红染区,其中P3组的染色相对淡一些。Ⅱ型胶原染色结果显示,P1、P3组染色较弱,棕褐色区域面积小,而P5组染色相对明显,细胞量及棕褐色区域相对多。结论本研究结果表明,不同代数的软骨细胞对三维共培养体系中ATDC5的成软骨分化效果有着不同的影响。其中,P1组软骨细胞的成软骨诱导效果较差,原因可能是和P1组转基因软骨细胞的TGF-β3释放量较低有关,不足以诱导ATDC5向软骨分化。相对于P1、P3组,P5组显示出较好的促软骨分化效果。然而在共培养期间P5组软骨细胞的去分化程度是最高的。不过,这些实验数据也进一步验证了构建共培养体系控释TGF-β3的可行性。通过更长时间的扩增可获得更多的P5软骨细胞,一方面可满足软骨组织工程的种子细胞数量的要求。另一方面,去分化程度越高,越接近凋亡的状态,从而可通过控制转染软骨细胞的凋亡来终止TGF-β3的释放,使间充质干细胞（MSCs）处于一个最佳TGF-β3浓度和时间下进行软骨分化,避免过量的TGF-β3对新分化生成的软骨细胞造成肥大、钙化甚至凋亡。