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椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration,IDD）所引起的下腰痛（Low back pain,LBP）是常见且严重的公共卫生健康问题。虽然保守治疗及外科手术治疗是目前医学中比较主流的治疗手段,但目前治疗所导致的较高的复发率和较多的并发症,促使急需寻求新的药物及治疗方法。因此,进一步明确IDD的发病机制尤为重要。本实验拟通过初步探寻G蛋白偶联受体P2Y2受体（P2Y2 Receptors,P2Y2Rs）和 Hippo 信号通路下游元件 Yes-相关蛋白（Yes-associated Protein,YAP）在椎间盘髓核组织促炎症因子释放的机制,为深入全面研究YAP介导的P2Y2受体（P2Y2 Receptors,P2Y2Rs）激活促椎间盘退变机制研究打下基础。第一部分 P2Y2受体和YAP在人退变的椎间盘髓核组织中表达变化采用人退变椎间盘髓核组织研究P2Y2受体（P2Y2 Receptors,P2Y2Rs）和YAP在椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration,IDD）组织中的表达情况。[方法]选取人退变的椎间盘髓核组织,依据Pfirrman分级,将髓核组织分为轻度退变组（Light Intervertebral Disc Degeneration,LIDD）,中度退变组（Moderate Intervertebral Disc Degeneration,MIDD）和重度退变组（Severe Intervertebral Disc Degeneration,SIDD）。采用双标荧光免疫组织化学技术（Immunofluorescence technique,IF）和共聚焦显微镜检测P2Y2Rs和YAP在人椎间盘髓核组织中的表达情况;利用Western blot技术来明确P2Y2Rs和YAP在不同退变程度的髓核组织中的表达情况;[结果]（1）选取MIDD患者椎间盘髓核组织进行双标免疫荧光组织化学（IF）实验,发现P2Y2Rs和YAP共表达在髓核组织中。（2）髓核组织Western blot结果表明:在退变的椎间盘髓核组织中,P2Y2Rs、YAP表达量明显升高。与LIDD组相比,MIDD组和SIDD组P2Y2Rs和YAP蛋白表达量显著增加（p<0.01和0.001,n=6）;与MIDD组相比,SIDD组P2Y2Rs和YAP蛋白表达量无显著差异（p>0.05,n=6）。[结论]IF和Western blot结果表明,P2Y2Rs和YAP在椎间盘髓核组织中共同表达。且在中度退变至重度退变的椎间盘髓核组织中,它们的蛋白表达量显著增加。提示它们可能参与了 IDD的发病过程。第二部分 培养的人退变椎间盘髓核细胞中,P2Y2Rs激活通过促进YAP表达及活化参与椎间盘退变发病过程[目的]在培养人退变的椎间盘髓核细胞中,探寻P2Y2Rs和YAP参与椎间盘退变发生的机制。[方法]（1）观察P2Y2Rs与YAP的共表达情况:选取1代人退变椎间盘髓核细胞（Nucleus Pulposus Cells,NPCs）,经过72 h预处理后实验。预处理具体方法描述如下:用含有10%FBS的DMEM/F-12培养基培养60h后,再用含有1%FBS的DMEM/F-12培养基饥饿细胞12 h。双标荧光免疫组织化学技术（Immunofluorescence technique,IF）和共聚焦显微镜技术观察 P2Y2Rs 和 YAP在人椎间盘NPCs中表达和定位情况。（2）观察P2Y2Rs激活时,YAP的表达变化:分别用10μM,100μM,500μM,1000μM,浓度的P2Y2Rs激动剂UTP对NPCs孵育24 h后,用荧光免疫组化技术（IF）观察YAP在髓核细胞（Nucleus Pulposus Cells,NPCs）细胞质和细胞核中的表达情况;将1代预处理后的NPCs分成三组（Control组,UTP组和UTP+AR-C118925XX组）,应用western-blot检测YAP的蛋白表达变化。（3）观察P2Y2Rs激活对NPCs凋亡的影响:应用TUNEL法检测不同浓度（10μM,100μM,500μM,1000μM）的 UTP 对 NPCs 孵育 24 h 后,NPCs 的凋亡情况。（4）观察UTP孵育的髓核细胞培养基炎症因子的含量:应用ELISA技术,测定不同浓度（10μM,100μM,500μM,1000μM）的 UTP 对 NPCs 孵育 24 h后,细胞培养基中IL-1β,IL-6和TNF-α含量;将预处理后的NPCs分成三组（Control 组,UTP 组和 UTP+AR-C118925XX 组）,取细胞培养基测定IL-1β,IL-6和TNF-α的含量。（5）观察P2Y2Rs激活对细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的影响:用IL-1β对髓核细胞（Nucleus Pulposus Cells,NPCs）致炎,构建椎间盘退变的细胞模型。在炎性环境中,分别运用YAP受体激动剂Lysophosphatidic acid（LPA）,YAP受体拮抗剂Verteporfin（Ver）以及P2Y2Rs拮抗剂AR-C 118925XX孵育细胞,应用western-blot检测NPCs中Ⅱ型胶原（Collagen Type Ⅱ,COII）和蛋白聚糖（Aggrecan,AGC）蛋白表达变化。[结果]（1）成功培养出髓核细胞后,IF结果表明,P2Y2Rs和YAP大量共表达。其中,P2Y2Rs主要表达在细胞膜上,而YAP在细胞质和细胞核内均有表达;（2）IF结果表明UTP≥100μM时,YAP在细胞核中表达增加（p<0.01,n=4）;Western blot结果表明,与Control组比较,UTP组YAP蛋白表达增加（p<0.05,n=3）;相反,P2Y2Rs的抑制使YAP表达量显著降低（p<0.05,n=3）。提示P2Y2Rs的激活增加了 NPCs中YAP蛋白表达,并且促进了 YAP入核,从而使其可能发挥生物学活性。（3）TUNEL凋亡检测表明,500μM UTP孵育NPCs 24 h后开始出现细胞凋亡,1000μMUTP使细胞凋亡增加。说明P2Y2Rs的激活,促进NPCs的细胞凋亡。（4）细胞培养基 ELISA 结果显示,UTP≥1000μM 时,IL-1β,IL-6 和 TNF-α含量均显著增加（p<0.001,n=3）。值得注意的是,UTP为10μM时,IL-6的含量增加具有统计学意义（p<0.01,n=3）,提示小剂量的UTP激活P2Y2Rs后易介导髓核细胞的IL-6释放。将1代预处理后的NPCs分成三组（Control组,UTP组和UTP+AR-C118925XX组）,ELISA检测细胞培养基发现,抑制P2Y2受体,可以显著降低IL-1β,IL-6和TNF-α的含量（p<0.01,n=3）。（5）在炎性环境中,抑制P2Y2Rs的表达,使NPCs内YAP含量降低,同时多聚蛋白聚糖（Aggrecan,AGC）的表达显著减少。YAP的激动或抑制均降低NPCs内细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的表达,但激动YAP后多聚蛋白聚糖（Aggrecan,AGC）的降低最为明显（p<0.01,n=5）。[结论]（1）在人椎间盘髓核细胞中,P2Y2Rs通过激活YAP,促进细胞凋亡,增加IL-1β,IL-6和TNF-α的分泌,降低ECM中AGC的含量,从而参与椎间盘退变的发病过程。（2）其中,100μM浓度的UTP激活P2Y2Rs导致YAP活化,并未出现髓核细胞的凋亡,但促进炎症因子IL-1β和IL-6释放,间接诱导IDD过程。1000μM浓度UTP激活P2Y2Rs,通过增加YAP活化,促炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α释放,诱导髓核细胞凋亡,部分减少ECM,从而参与IDD发病过程。