Cu2+对隆线溞生长繁殖及Chemosensory基因表达的影响

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将隆线溞(Daphnia carinata)作为本文研究的对象,采用分子生物学、毒理学以及生物化学等相关学科的方法和技术,通过控制外部的环境条件,探究了CU2+对隆线溞生长繁殖的影响,以及对隆线溞Chemosensory基因表达的影响。主要结果如下:1.Cu2+对隆线溞生长、繁殖以及体内抗氧化酶类的影响为了研究Cu2+污染的水体对隆线溞生长、繁殖以及其体内抗氧化酶类的影响,将Cu2+浓度设定了五个组,包括0 μg·L-1、2μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1及16μg·L-1,经过21天的养殖试验。试验结果表明:不同浓度的Cu2+并不直接改变隆线溞的生殖方式。伴随Cu2+浓度的增大,隆线溞的内禀增长率、其后代的总生殖量以及净生殖率皆呈先上升后下降的现象,以4μg·L-1时最高。但是产第一胎幼溞的时间和平均世代周期均被延长,以高浓度组(16μg·L-1)影响较为明显(P<0.05)。同时其存活时间也被缩短,高浓度组(16μg·L-1)平均存活了10d左右。4μg·L-1时,其体长最长,而高浓度组(16 μμg.L-1)体长最短。但是CU2+对其生殖间隔期没有明显的影响。Cu2+对隆线溞超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)活性的影响皆呈先升高后下降的现象,在Cu2+浓度4μg·L-1时,其SOD及CAT活性皆达到峰值。而对于POD的活性,伴随Cu2+浓度的增大,则呈现一直递增的现象。2.隆线溞DacaCSP2和DacaCSP3基因全长克隆及其序列分析成功获得两条隆线溞Chemosensory基因的cDNA全长,分别命名为DacaCSP2(GenBank登录号:KM624608)和DacaCSP3(GenBank登录号:KM624609)。其中DacaCSP2基因全长是632bp,DacaCSP3基因全长是935 bp。DacaCSP2和DacaCSP3的ORF编码的蛋白均具有OS-D superfamily功能域,均含有半胱氨酸位点、2Fe-2S型铁硫蛋白结合位点以及过敏毒素结合位点等。对隆线溞的1)acaCSP2和DacaCSP3基因编码的蛋白做同源性对比,结果表明,其序列皆比较保守,并且与蚤状溞(Daphnia pulex)的相似度最高(83%)。对其生物起源进行分析,结果表明,隆线溞与蚤状溞的亲缘关系最近。3.隆线溞DacaCSP2和DacaCSP3基因的表达分析Real-time PCR分析表明,无论是DacaCSP2基因还是DacaCSP3基因,其mRN A表达水平在不同的溞体内皆不同,并且差异明显。对于雄性溞,其mRNA的表达水平最低;而对于两性溞,其mRNA的表达水平最高。从研究结果可以推测,DacaCSP2和DacaCSP3基因可能在隆线溞不同生殖状态的溞体中起到一定的调控作用。4.隆线溞DacaCSP2和DacaCSP3基因的空间定位分析原位杂交结果表明,无论是DacaCSP2基因还是DacaCSP3基因,对于两性溞,其]mRN A大部分在其卵巢、夏卵和第二触角表达,胸肢和直肠也有表达;对于孤雌溞,其mRNA大部分在卵巢和第二触角表达,胸肢和直肠也有表达。以上结果表明DacaCSP2和DacaCSP3基因可能在隆线溞不同的生殖方式中发挥了作用。5.Cu2+对隆线溞DacaCSP2和DacaCSP3基因表达的影响用不同浓度的Cu2+刺激隆线溞,分析隆线溞DacaCSP2和DacaCSP3基因的mRNA的表达水平的差异。实验结果表明,伴随Cu2+浓度的增大,隆线溞DacaCSP2和DacaCSP3基因的mRNA表达水平皆呈先升高后下降的现象。在4γg·L-1时,DacaCSP2和DacaCSP3基因的mRNA表达水平最高。以上实验结果表明,当隆线溞受到不良外部环境条件的刺激时,其CSPs基因就开始起作用,表明其在应激反应中发挥着一定的功能,以防止溞体本身受到伤害,同时也为其后代的生存提供更大的机会。因此,推测DacaCSP2和DacaCSP3基因在隆线溞的生长和生殖中可能发挥着一定的作用。
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