【摘 要】
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目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）易发生多器官功能障碍,发病机制未完全明确,可能与激活细胞焦亡导致炎症级联扩大反应及胰腺导管上皮屏障功能受损有关。本文探讨雨蛙肽（caerulin,CAE）干预胰腺导管上皮细胞后是否出现细胞焦亡现象,以及CAE对细胞焦亡相关基因:天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase
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目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）易发生多器官功能障碍,发病机制未完全明确,可能与激活细胞焦亡导致炎症级联扩大反应及胰腺导管上皮屏障功能受损有关。本文探讨雨蛙肽（caerulin,CAE）干预胰腺导管上皮细胞后是否出现细胞焦亡现象,以及CAE对细胞焦亡相关基因:天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1）、核苷酸结合寡聚结构域样受体家族3[nucleotide‐binding oligomerization domain（NOD）‐like receptor family,pyrin domain containing1,NLRP3]、效应产物炎症因子白介素-1β（Interleukin-1 beta,IL-1β）等表达的影响;探讨CAE所致的细胞焦亡机制是否与肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor Necrosis Factor Receptor-associated Factor 6,TRAF6）基因调控有关。方法:本文以人胰腺导管上皮细胞HPDE6C7细胞株为研究对象。（1）用CAE干预,按干预不同时间点分组,分为空白组、12h、24h、48h,共4组。利用Hoechst/PI双染检测细胞焦亡现象;提取各组总RNA,利用实时荧光定量PCR检测细胞焦亡相关蛋白caspase-1、NLRP3 mRNA的表达水平;收集各组细胞培养上清液,ELISA法检测IL-1β的浓度;（2）用慢病毒转染技术上调HPDE6C7细胞株的TRAF6基因表达,构建TRAF6过表达稳转株（TRAF6组）以及空载病毒转染作为空载对照（Blank组）,再利用CAE干预48h,分为TRAF6组、Blank组、TRAF6+CAE组、Blank+CAE组,共4组。利用Hoechst/PI双染法观察是否存在细胞焦亡现象;实时荧光定量PCR及免疫印迹法检测TRAF6、caspase-1、caspase-3、NLRP3的表达量以及ELISA法检测细胞上清液中IL-1β的表达水平。结果:（1）CAE干预后,可见各组均出现细胞变圆肿胀,坏死,红色荧光增多,以48h最为明显;实时荧光定量PCR结果显示HPDE6C7细胞中NLRP3、caspase-1的mRNA表达水平均增高。其中,NLRP3 mRNA表达水平随着干预时间增加而增加,在48h表达量最高,与其他组比较存在统计学差异（P<0.05）;而caspase-1的mRNA表达水平在12h最高,后续稍下降并处于平稳,但仍高于空白组,各组之间两两比较有统计学差异（P<0.05）;ELISA结果可见:CAE干预12h、24h、48h后,细胞培养上清液中IL-1β浓度分别为（1061.43±6.99）pg/ml、（1376.17±3.12）pg/ml、（5836.26±3.02）pg/ml,均较空白组增加,且呈时间依赖性,48h最为明显,各组之间两两比较均有显著统计学意义（P<0.05）;（2）慢病毒转染上调HPDE6C7细胞的TRAF6基因表达后,实时荧光定量PCR及免疫印迹法结果显示:TRAF6组TRAF6基因表达水平明显高于空白组和空载组（P<0.05）,细胞转染成功;TRAF6组可见少量坏死细胞,且NLRP3、caspase-3表达水平比Blank组增加;利用CAE干预48h后,TRAF6+CAE组、Blank+CAE组均出现大量细胞坏死,TRAF6+CAE组与Blank+CAE组比较,细胞坏死更明显;免疫印迹法结果示TRAF6+CAE组较Blank+CAE组的caspase-1、caspase-3、NLRP3表达量上调（P<0.05）;ELISA法结果显示TRAF6+CAE组、Blank+CAE组中细胞培养上清液IL-1β浓度较CAE干预前增加,且TRAF6+CAE组的IL-1β浓度比Blank+CAE组增加（P<0.05）。结论:（1）CAE可能通过caspase-1或capase-3途径激活胰腺导管上皮细胞发生细胞焦亡。（2）TRAF6基因高表达可引起胰腺导管上皮细胞NLRP3、cleaved caspase-1、caspase-3、IL-1β表达上调,并激活细胞焦亡。
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