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第一部分透明质酸对苯扎氯铵诱导角膜上皮细胞DNA损伤保护作用的研究目的苯扎氯铵(benzalkonium chloride, BAC)是目前临床使用的滴眼液中常添加的防腐剂。本研究拟探讨苯扎氯铵对体外培养的人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cells, HCEs)DNA损伤、活性氧(reactive oxygen species, ROS)、细胞存活率及细胞凋亡的影响,以及透明质酸对苯扎氯铵所致的人角膜上皮细胞DNA毒性效应的保护作用。方法用浓度为0.00005%、0.0001%、0.0005%及0.001%的苯扎氯铵分别作用于体外培养的人角膜上皮细胞30分钟,另一组细胞采用0.2%透明质酸与不同浓度苯扎氯铵联合作用30分钟。应用甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测细胞存活率；用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡；碱性彗星实验用于检测以DNA单链断裂(DNA single-strand breaks、SSBs)为主的DNA损伤；用免疫荧光法检测细胞核内磷酸化的H2AX (γH2AX)焦点形成,以评估以DNA双链断裂(DNAdouble-strand breaks, DSBs)为主的DNA损伤情况及严重程度；以乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)为探针,应用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。结果MTT结果表明,0.001%苯扎氯铵可导致显著的细胞存活率下降(P<0.001),凋亡实验也显示,仅0.001%苯扎氯铵可致显著的HCEs细胞凋亡(P<0.001)。而碱性彗星实验则显示,四个浓度的苯扎氯铵均可导致显著的HCEs细胞核SSBs(P<0.001)。免疫荧光法也发现不同浓度的苯扎氯铵处理后HCEs细胞核内含有yH2AX焦点的细胞比例及焦点数均较对照组显著增加(P<0.05),表明苯扎氯铵可导致HCEs细胞核DSBs形成。随浓度的增加,苯扎氯铵所致的DNA损伤加重。流式细胞仪检测表明,不同浓度苯扎氯铵处理后的HCEs细胞内ROS水平较对照组增高,差异有显著性(P<0.001)。而混合有透明质酸的苯扎氯铵作用于HCEs30分钟后则显著抑制了苯扎氯铵所致的细胞存活率下降、细胞凋亡、DNA损伤及细胞内ROS水平增高。结论苯扎氯铵可导致HCEs细胞核DNA损伤并影响细胞活性。苯扎氯铵所致的细胞内ROS增加可能与DNA损伤相关。透明质酸可抑制苯扎氯铵所致的角膜上皮细胞DNA损伤、ROS增加及细胞凋亡。corneal epithelial cells, HCEs)DNA损伤、活性氧(ROS)、细胞存活率、细胞凋亡的影响,以及透明质酸对EDTA所致的人角膜上皮细胞DNA毒性效应的保护作用。方法用浓度为0.00001%、0.0001%、0.001%及0.01%的EDTA分别作用于体外培养的人角膜上皮细胞30分钟,另一组细胞采用0.2%透明质酸预处理30分钟后,再用不同浓度EDTA作用30分钟。应用甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测细胞存活率；用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡；碱性彗星实验用于检测以DNA单链断裂(DNA single-strand breaks, SSBs)为主的DNA损伤；用免疫荧光法检测细胞核内磷酸和的H2AX(γH2AX)焦点形成,以评估以DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)为主的DNA损伤情况及严重程度；以乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)为探针,应用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。结果EDTA未降低角膜上皮细胞存活率或导致细胞凋亡(P>0.05)。但碱性彗星实验显示,低浓度的EDTA即可导致显著的HCEs细胞核SSBs (P＜0.01).γH2AX免疫荧光法也发现不同浓度的EDTA处理后的HCEs细胞核内含有γH2AX焦点的细胞比例及焦点数均较对照组显著增加(P<0.05)。流式细胞仪检测表明,不同浓度EDTA处理后的HCEs细胞内ROS水平较对照组增高,差异有显著性(P<0.01)。而用透明质酸预处理30分钟后的HCEs则未见EDTA所致的DNA损伤及细胞内ROS水平增高。结论EDTA可诱导HCEs细胞核DNA损伤,可能与EDTA所致的细胞内ROS增加有关。而透明质酸预处理后可抑制EDTA所致的角膜上皮细胞DNA损伤及ROS增加。