研究背景和目的： 人自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)是机体先天非特异性免疫系统的主要细胞成分之一，约占循环淋巴细胞的15％左右，在抗病毒、抗真菌、抗肿瘤和移植排斥反应中起十分重要的作用。NK 细胞杀伤破坏靶细胞时不需要预先致敏，所以在免疫应答的早期发挥作用。NK 细胞表面表达不同的受体，如 KIR(Killercell Ig-like receptors)、TLR 等，TLR因与天然免疫和获得性免疫有关而倍受关注。 根据CD56和CDl6分子表达与否，可以将NK细胞分为三个主要的亚群，即CD56<+>CD16<->、CD56<+>CD16<+>和CD56<->CD16<+>细胞群。NK 细胞不仅参与机体的非特异性免疫应答，同时释放细胞因子来调节特异性免疫行使调节功能。 TLR (toll like receptor) 是一类模式识别受体，能够被微生物的特异性成分和某些宿主分子所激活，引发信号传导，导致炎症介质的释放，它们构成了防御病原体的第一道防线。TLR 在固有免疫中起着决定性作用并最终激活获得性免疫。目前己发现10余种TLR家族成员，主要表达在具免疫功能的组织中，而NK细胞上表达TLR3、TLR7和TLR8等。 NK细胞在病毒感染的早期免疫应答中起着重要的作用，分布在NK细胞上的TLR行使一定的功能。他人动物实验中，某些TLR受体敲除的模型鼠感染鼠巨细胞病毒(MCMV)病理反应强烈，这一实验显示TLR信号的缺少会导致NK细胞活化以及免疫功能的削弱。 R-848 是一种小分子的免疫调节剂，具有抗病毒及抗肿瘤的作用。它可以通过TLR-7-MyD88依赖的信号系统来激活免疫细胞诱导细胞因子的产生，是人类TLR7和TLR8的配体，具有活化NK细胞对靶细胞的细胞毒作用以及刺激NK细胞的某些亚群产生IFN-γ的作用。而这种作用是辅助细胞依赖性的，当添加了IL-12中和抗体后，R-848对于NK细胞的这种刺激作用就会被抑制。IL-12是一种可以激活NK细胞产生IFN-γ和增强其细胞毒性的细胞因子，和R-848有协同作用。因此推测存在于NK细胞上的TLR7/8与相应配体R-848结合，可以使NK细胞的功能直接或间接被刺激活化，并可促进IL-12对NK细胞的作用，这种作用是否和NK细胞的不同亚群相关，目前尚未见相关的报道。 因为对于TLR的作用与NK细胞亚群的联系所知甚少，我们利用人工合成的TLR7/8配体R-848作用于NK细胞，以探讨其对于NK细胞IFN-γ、颗粒酶、穿孔素以及杀伤功能等生物学功能的影响以及与IL-12共同对于NK细胞的作用，为临床关于利用NK细胞上TLR进行免疫治疗提供理论和实验依据。 实验方法和结果： 1．为了探讨R-848是否直接作用于NK细胞，纯化NK细胞分别与R-848、IL-12以及R-848和IL-12培养，所获结果是R-848单独培养组不能诱导IFN-γ的产生和表达；R-848和IL-12共同培养后促进了CD56CD16<->亚群和CD56CD16<->亚群IFN-γ<+>的表达。 2．用PBMC分别与R-848、IL-12以及R-848和IL-12培养，流式细胞术结果分析NK细胞群体CD25表达的变化，结果发现R-848和BIL-12分别对于NK细胞具有活化作用，但两者并无明显的协同作用。 3．为了探讨R-848对于NK细胞的细胞毒性的作用，利用R-848与PBMC培养收集细胞，流式细胞术结果分析颗粒酶和穿孔素的变化。而在R-848刺激下，各个NK亚群穿孔素和颗粒酶并无太大变化。 4．为了探讨R-848对于NK细胞杀伤功能的影响，我们将新鲜分离的PBMC分别与R-848、IL-12以及R-848和IL-12共同培养后作为效应细胞，再与K562靶细胞孵育后，进行流式细胞仪检测，结果表明R-848和IL-12均能增强NK细胞的杀伤功能，并随着效靶比的升高而增强。但R-848与IL-12对于增强NK细胞的杀伤作用并无协同性。 结论： 本文研究证明了R-848可以刺激PBMC中NK细胞以剂量依赖的方式产生IFN-γ，而这种作用可以被抗IL-12抗体中和。R-848和IL-12对于刺激纯化NK细胞产生IFN-γ的作用具有显著的正向协同作用。产生IFN-γ的细胞群主要是CD56CD16<->亚群。R-848和IL-12对于NK细胞的活化和杀伤功能都具有促进作用，但二者无协同作用。R-848对于NK细胞颗粒酶和穿孔素的合成无增强作用，提示R-848对于NK细胞活化以及杀伤具有直接的增强作用，但对于杀伤功能的增强不是通过颗粒酶和穿孔素途径，而是另有机制。我们的研究为R848通过TLR7/8抗病毒抗肿瘤的独特机制提供了一定的理论依据，显示了R-848作为新型的免疫调节剂在用于病毒肿瘤治疗方面的广阔前景。