[研究背景]在世界范围内,乳腺癌已是目前女性最常见的恶性肿瘤。在我国,乳腺癌近10年的发病率增加了30%。因此如何准确判断乳腺癌患者预后,以及如何选择合理有效的治疗成为目前乳腺癌研究的重点。目前,大家公认的与乳腺癌患者预后相关的指标包括病人年龄、肿瘤组织学类型、组织学级别、肿瘤大小、肿瘤细胞增殖活性(ki67)、淋巴结转移、临床分期、雌孕激素受体(ER、PR)以及酪氨酸激酶生长因子受体2(Her-2,或C-erbB-2)的表达水平等临床病理学指标。在治疗方面,手术切除肿瘤仍是乳腺癌治疗的主要方法,此外,很多病人还接受术后辅助治疗,以期减少局部及远处肿瘤复发的风险。为了得到最佳的治疗效果,减少治疗的毒副作用,辅助治疗可选择化疗、放疗、内分泌及靶向治疗等。化疗在乳腺癌治疗中起重要作用,但研究表明,约90%的乳腺癌患者化疗失败归咎于多药耐药(multidrug resistance, MDR),因此MDR成为困扰乳腺癌治疗的难题之一。MDR由多种因素诱导,在一些耐药相关蛋白的作用下将药物从肿瘤细胞中泵出,肿瘤细胞内药物浓度降低,导致药物毒性下降,这些耐药相关蛋白都是膜蛋白,均属于ATP结合的盒式(ATP binding cassette, ABC)运输蛋白家族。缺氧是实体肿瘤进展的重要因素,而且与肿瘤细胞代谢、血管生成和转移的多个指标都密切相关。研究发现,肿瘤内广范缺氧的存在使放疗或化疗后生存率降低,而且缺氧与有很多肿瘤的预后不良密切相关。组织对缺氧的反应主要是通过缺氧诱导因子(Hypoxia-Inducible Factor, Hif), Hif-1a和Hif-2a来介导的。尽管这两种蛋白高度同源,但他们有不同的调控靶基因,并对肿瘤的生长起不同的作用。Karolina等研究发现Hi-2a与乳腺癌的不良预后有关,但没有发现Hi-1a有这种关系。ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member2,或breast cancer resistance protein, BCRP),是ABC转运蛋白超家族中的成员之一,是一种重要的跨膜转运蛋白,在多药耐药方面有着不可忽视的地位。目前对ABCG2结构、功能及其在多药耐药中的作用均进行了大量研究。研究表明,ABCG2启动子有两个功能区,分别是雌激素反应元件(estrogen response elements, ERE)及缺氧反应元件(hypoxia response elements, HRE)。启动子通过激活ABCG2基因上游的PPARg (peroxisome proliferator-activated receptor g)反应元件来控制ABCG2的表达。目前关于ABCG2及Hif-2a蛋白在乳腺癌细胞中的表达及其与前述乳腺癌相关临床病理指标的相关性的研究还未见报道。而ABCG2启动子有雌激素反应元件和缺氧反应元件两个功能区,提示我们ABCG2可能与ER等乳腺癌临床病理指标及Hi-2a等缺氧诱导因子存在相关性或调控关系。故我们在这些方面进行研究。在本研究中,我们首先采用组织芯片及免疫组化技术,分别检测196例人乳腺癌手术切除石蜡包埋标本中ABCG2及Hif-2a的表达,并对应用统计学方法分别分析ABCG2、Hif-2a的表达与前述乳腺癌临床病理指标(年龄、组织学类型、组织学级别、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、ER、PR、HER2以及Ki67等)及其ABCG2与Hif-2a之间的相关性,探讨ABCG2与启动子功能区相关的ER及Hif-2a蛋白在乳腺癌细胞中的表达及其是否存在相关性。继而,根据相关性研究的结果,构建能够持续特异性沉默Hif-2a表达的重组质粒pSUPER-siHif-2a,同时以随机干扰序列重组质粒pSUPER-siN为对照,分别转染人乳腺癌细胞株MCF-7及T47D。应用RT-PCR、Western Blot、MTT等技术方法检测干扰Hi-2a后,ABCG2mRNA、蛋白质及细胞耐药性的变化,探讨Hif-2a与ABCG2之间可能的调控关系,并提出在乳腺癌细胞内ABCG2可能是Hif-2α直接调节的下游靶基因这一论断。[实验方法]1、研究病例标本及组织芯片的制作选取山东大学齐鲁医院病理科存档的临床病理资料完整的196例浸润性导管癌蜡块,每例选取两个典型部位制作成组织芯片。2、免疫组化及相关性分析采用免疫组织化学二步法(PV-9000法)检测196例原发性乳腺浸润性导管癌组织中ABCG2及Hif-2a的表达情况,并设定染色强弱的判定标准,应用统计学分析了ABCG2及Hif-2a的表达与上述乳腺癌临床病理指标之间的相关性,以及ABCG2表达与Hif-2a表达的相关性。3、构建沉默Hif-2a表达的干扰质粒分别设计并合成针对Hif-2a基因的双链干扰RNA序列以及作为对照的非靶向性干扰序列,将其定向插入到质粒载体pSUPER.neo+GFP中,构建稳定表达载体pSUPER-siHif-2a和pSUPER-siN。酶切及测序鉴定正确后,大量扩增。4、细胞系的检测：应用RT-PCR、qRT-PCR、Western Blot等方法检测本实验室培养的人乳腺癌细胞系MCF-7及T47D中ABCG2及Hif-2a的1mRNA水平及蛋白水平。5、细胞培养及转染：构建的质粒载体分别转染细胞,培养48h后,通过RT-PCR及qRT-PCR检测各组细胞中Hif-2a mRNA和ABCG2mRNA的表达情况,应用Western blot检钡Hif-2a蛋白和ABCG2蛋白表达情况。应用MTT法检测各组细胞对米托蒽醌的半数细胞抑制浓度(IC50)的改变,评价干扰Hif-2a对细胞多药耐药性的影响。[实验结果]1、免疫组化结果：ABCG2免疫组化染色,着色部位为细胞浆及细胞膜。在乳腺浸润性导管癌的肿瘤组织内,ABCG2表达强弱不等分布不均。15例(占7.7%)为完全阴性,80例(占40.8%)为阳性+,77例(占38.2%)为阳性++,24例(占12.3%)为阳性+++。按照ABCG2表达高低的计算方法,结合阳性肿瘤细胞的比率,196例病例中,73例(占37.2%)ABCG2高表达,97例(占49.5%)低表达,26例(占13.3%)为阴性。Hif-2a免疫组化染色,着色部位在细胞核。在乳腺浸润性导管癌的肿瘤组织内,Hif-2a表达强弱不等分布不均。12例(占6.12%)为完全阴性,78例(占39.80%)为阳性+,69例(占35.20%)为阳性++,37例(占18.88%)为阳性+++。按照Hif-2a表达高低的计算方法,结合阳性肿瘤细胞的比率,196例病例中,57例(占29.08%)Hif-2a高表达,114例(占58.16%)低表达,25例(占12.76%)为阴性。2、ABCG2及Hif-2a的表达与乳腺癌临床病理指标之间的相关性,以及ABCG2表达与Hif-2a表达的相关性。统计分析表明,在乳腺浸润性导管癌细胞中ABCG2蛋白表达与HER-2表达明显正相关,与淋巴结转移及临床分期也有明显相关性。ABCG2蛋白表达水平与下列临床病理学指标未见明显相关性：病人年龄、组织学亚型、组织学分级、肿瘤大小、ER, PR、以及Ki67。统计分析表明,在乳腺浸润性导管癌细胞中Hif-2a蛋白表达与组织学分级及Ki67水平均有明显相关性。而且Hif-2a蛋白表达与/ABCG2表达明显正相关。Hif-2a蛋白表达水平与下列临床病理学指标未见明显相关性：病人年龄、组织学亚型、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、ER、PR、以及HER-2。3、转染干扰Hif-2a的质粒pSUPER-siHif-2a后相关实验结果干扰Hif-2a的质粒pSUPER-siHif-2a转染后,MCF-7/pSUPER-siHif-2a及T47D/pSUPER-siHif-2a细胞中,Hif-2a基因的mRNA水平及蛋白表达水平均明显降低,证明干扰效果良好。而在干扰后细胞中ABCG2的mRNA水平及蛋白表达水平也明显减低,说明Hif-2a与ABCG2之间可能存在直接或间接的调控关系。MTT法检测细胞对化疗药物的耐受性,发现干扰组细胞对米托蒽醌的IC50明显降低,相对耐药指数显著下降,耐药性被不同程度逆转。[结论]1、ABCG2表达于大多数(86.7%)乳腺浸润性导管癌细胞中,其中40%的病例为高表达。而且ABCG2蛋白的表达与浸润性导管癌HER2表达、淋巴结转移和临床分期有显著相关性。提示ABCG2不仅是一种耐药相关蛋白,而且可能是一种能够预测乳腺癌生物学行为、临床侵袭性,判断预后及化疗效果的新的标记物。2、Hif-2α表达于大多数(87.24%)乳腺浸润性导管癌细胞中,其中29.08%的病例为高表达。而且Hif-2a蛋白表达与浸润性导管癌中ABCG2蛋白的表达以及组织学分级、Ki67表达均有明显相关性。提示Hif-2a不仅是一种缺氧诱导因子,而且可能是一种能够预测乳腺癌恶性生物学行为以及化疗效果不良的新的标记物。3、在乳腺癌细胞内,ABCG2的]mRNA水平及蛋白表达水平随着Hif-2α的改变而改变,与Cindy M. Martin等在心脏边缘细胞中的实验结果一致,提示在乳腺癌细胞内ABCG2可能也是Hif-2a直接调节的下游靶基因；而且Hif-2a参与ABCG2介导的乳腺癌细胞多药耐药,有可能是缺氧导致肿瘤细胞耐药性增强的新机制。干扰Hif-2a的表达可抑制ABCG2基因的表达,并部分逆转肿瘤的耐药性,提示Hif-2a有望作为预示乳腺癌预后的指标以及逆转ABCG2介导的多药耐药研究的新靶点。