研究背景喉癌是颈部发生率较高的恶性肿瘤,临床上可分为声门型(占60.0%)、声门上型及声门下型三种,且男性发病率略高于女性。喉癌分为原发性与继发性两种。原发性喉癌是指原发部位在喉部的肿瘤,临床以鳞状细胞癌最为常见;而继发性喉癌是指源于其他部位的恶性肿瘤转移到喉部(临床较为少见)。对于确诊的喉癌可采用外科手术、化疗或放疗等手段进行治疗,不同治疗方法各有优缺点,但总的治疗效果仍不满意,远期生存率较低,预后较差。喉癌的发生、发展被认为是癌基因与抑癌基因功能失衡的结果。因此,积极寻求基因水平治疗靶点成为当前研究的热点。近年来,随着医疗技术的不断发展,越来越多的研究发现在人类基因组中仅有不到2%的基因能被编码转录为蛋白质,多数基因由于缺乏完整的开放阅读框,难以编码蛋白质(称为非编码RNA)。临床上,根据核苷酸长链长度分为短链非编码RNA和长链非编码RNA(LncRNA)两种。短链非编码RNA是指长度<200nt的非编码RNA;而LncRNA属于是一类长度>200nt的非编码RNA,主要定位于细胞核与细胞浆内,能以表观转录调控及转录后调控等多种调控方式直接参与肿瘤的发生、发展。目前,临床上与喉癌有关的LncRNA类型较多,包括:HOTAIR、MALAT1、H19等,均在喉癌的发生、发展中发挥了重要的作用。加强认识LncRNA在喉癌中的作用能提高喉癌的早期诊断和治疗,亦可提高术后生活质量。转录因子SOX2是SOX家族的一员,且临床已发现该家族在人类、小鼠中共有成员20多个。SOX2属于该家族的B组成员,含有一个外显子,且蛋白表达序列高度保守。SOX2能表达于成人多种正常组织中,但是在诸多肿瘤组织中表达异常。同时,SOX2亦是维持胚胎干细胞的自我更新、分化潜能的重要因子。有研究表明:SOX2-OT和SOX2在肺癌、食管癌、乳腺癌等多种肿瘤中异常表达,能直接参与肿瘤的发生、细胞的分化及多潜能作用。SOX2过度表达与喉鳞状细胞癌的恶性进展有关,能作为喉鳞状细胞癌预后的重要指标。但是,LncRNA SOX2-OT在喉癌中的临床意义、生物学功能尚未阐明。肿瘤细胞与正常细胞相比,肿瘤细胞具有无限增殖、转化及转移的特点,且基于上述特点导致临床诊断、治疗难度较大。同时,肿瘤转移是恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤,到达继发组织或器官中继续生长、增殖而引起继发组织和器官发生癌变的过程。因此,肿瘤的转移对于肿瘤的死亡率、病情的发生、发展具有重要的作用。转移瘤治疗难度相对较大,一方面是由于转移瘤治疗过程中需要兼顾原发瘤;另一方面临床对于转移瘤的转移机制尚未阐明,尤其多数患者确诊前肿瘤细胞已经发生区域淋巴结转移,部分患者甚至发生远处转移。而SOX2-OT能参与多种肿瘤细胞的侵袭和转移。目前,临床上对于LncRNA SOX2-OT靶向miR-654在喉癌侵袭转移调控机制研究相对较少。研究目的SOX2属于SRY相关的SOX基因家族中的一种,能维护自我更新与未分化胚胎干细胞等多潜能性。同时,SOX2基因嵌入到LncRNA内含子中,能引起SOX2重叠、转录,形成SOX2-OT,但是在鳞状细胞癌中的生物学特性及作用机制研究较少。本研究主要探讨在体外对SOX2-OT干预后对喉鳞状细胞癌增殖、侵袭、转移及凋亡的作用,初步探究其潜在的分子机制,为喉鳞状细胞癌在临床治疗提供新的靶点。研究方法(1)LncRNA SOX2-OT在不同细胞中的表达。购置喉鳞状细胞癌细胞TU177、TU686、M4E、AMC-HN-8作为研究对象,将其分装不同试管中;同时购置正常细胞株NP69作为对照,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术测定不同细胞中LncRNASOX2-OT表达水平,选择差异性最大的细胞株进行后续试验;选择对数生长期的喉鳞状细胞癌细胞,并利用Lipofectamine2000转染,构建shRNA对 LncRNASOX2-OT 的表达进行干扰,形成 shRNA-NC、shRNA-SOX2-OT-1,设定对照细胞,RT-PCR技术测定不同细胞中miR-654表达水平;(2)LncRNASOX2-OT靶向miR-654在喉癌侵袭转移调控作用。对构建成功的shRNA-NC、shRNA-SOX2-OT-1及对照细胞,采用CCK8技术检测三种细胞Oh、24h、48h及72h细胞活性;利用划痕试验检测三种细胞Oh、6h、12h及24h细胞迁移水平;采用Transwell检测三种细胞Oh、6h、12h及24h细胞侵袭能力,并利用Western blot测定三种细胞增殖、迁移及凋亡相关蛋白表达,细胞增殖蛋白包括:CDK2、cyclinE1、PCNA和P21;细胞迁移蛋白包括:MMP7、MMP9;凋亡相关蛋白包括:Bax,cleaved caspase-3,bcl-2。观察SOX2-OT干预后对喉鳞状细胞癌增殖、侵袭、转移及凋亡的作用和影响。采用美国promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统,根据实验说明进行操作,检测LncRNASOX2-OT和miR-654的靶向关系;应用shRNA与miR-654 inhibitor完成共转染,并检测转染后细胞增殖与凋亡水平,采用CCK8技术检测shRNA-SOX2-OT-1,shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC,shRNA-SOX2-OT-1+miR-654 inhibitor三种细胞Oh、24h、48h及72h细胞增殖水平;利用Western blot测定三种细胞凋亡相关蛋白表达,凋亡蛋白包括:Bax、bcl-2、cleaved caspase3。流式细胞仪检测细胞凋亡比率。本研究中所有数据均采用SPSS20.0软件处理。研究结果第一部分。①经PCR扩增、凝胶电泳富集及PCR产物回收后,给予浓度为1%凝胶电泳完成PCR及PCR回收产物的检测,结果表明:PCR回收后目的大小在969bP部位出现特异性条带,鉴定目的基因SOX2-OT扩增成功;挑取白色菌落,完成菌落PCR鉴定,进一步确定插入相应的片段,结果表明:菌落1、3、4、5均为阳性克隆。选择阳性克隆完成相应序列的测定,最终标记为SOX2;重组质粒在不同目标大小中存在特异性条带;测序结果表明重组质粒成功构建,并标记为 pEGFP-N1-SOX2;②将带有绿色荧光标记的shRNA-NC、shRNA-SOX2-OT-1通过Lipo2000转染到喉癌细胞TU177中,连续完成24h转染,倒置显微镜下观察不同细胞的绿色荧光情况,对于存在细胞形态的绿色荧光说明转染成功,干扰率超过60.0%;③shRNA-SOX2-OT-1细胞中miR-654表达水平高于对照组细胞及shRNA-NC 细胞(P<0.05);shRNA-SOX2-OT-1 及 shRNA-SOX-OT-1+miR-NC细胞中miR-654表达水平无统计学意义(P>0.05);均高于shRNA-SOX2-OT-1+miR-654-inhibitor 细胞(P<0.05);④细胞转染前AMC-HN-8及TU686细胞LncRNA SOX2-OT mRNA表达水平无统计学意义(P>0.05);均高于M4E细胞及NP69细胞(P<0.05);TU177细胞转染前LncRNA SOX2-OT mRNA表达水平高于其他四种细胞(P<0.05);TU177细胞转染后shRNA-NC及对照组细胞LncRNA SOX2-OT mRNA表达水平无统计学意义(P>0.05);均高于 shRNA-SOX2-OT-1及shRNA-SOX2-OT-2 细胞(P<0.05)。第二部分:①TU177对照细胞、shRNA-NC细胞在Oh、24h、48h及72h细胞活性比较无统计学意义(P>0.05);shRNA-SOX2-OT-1细胞Oh、24h、48h及72h细胞活性低于对照细胞、shRNA-NC细胞(P<0.05);②划痕试验结果表明:TU177对照细胞、shRNA-NC细胞及shRNA-SOX2-OT-1细胞Oh点划痕距离比较无统计学意义(P>0.05)(对照组细胞划痕距离略小);24h时对照细胞、shRNA-NC细胞划痕距离无统计学意义(P>0.05);shRNA-SOX2-OT-1细胞24h划痕距离大于对照细胞、shRNA-NC细胞(P<0.05);③Transwell检测结果表明:TU177对照细胞、shRNA-NC细胞迁移、侵袭率比较无统计学意义(P>0.05);shRNA-SOX2-OT-1细胞迁移、侵袭能力均低于对照细胞、shRNA-NC细胞(P<0.05);结晶紫染色结果表明:对照细胞、shRNA-NC细胞结晶紫染色下穿过Transwell的细胞比例无统计学差异性,但是明显大于 shRNA-SOX2-OT-1 细胞(P<0.05),说明 shRNA-SOX2-OT-1 细胞迁移/侵袭能力较差;④Western blot测定增殖相关蛋白结果表明:TU177对照细胞、shRNA-NC细胞CDK2、cyclinE1、PCNA蛋白表达水平无统计学意义(P>0.05);对照细胞、shRNA-NC细胞CDK2、cyclinE1、PCNA蛋白表达水平均高于shRNA-SOX2-OT-1 细胞(P<0.05),P21 蛋白表达水平低于 shRNA-SOX2-OT-1细胞(P<0.05);Western blot测定迁移相关蛋白结果表明:TU177对照细胞、shRNA-NC细胞迁移蛋白MMP7、MMP9表达水平无统计学意义(P>0.05),shRNA-SOX2-OT-1细胞迁移蛋白MMP7、MMP9表达水平低于对照细胞、shRNA-NC细胞(P<0.05)。Western blot测定凋亡相关蛋白结果表明:TU177对照细胞、shRNA-NC细胞凋亡蛋白Bax,cleaved caspase-3表达水平无统计学意义(P>0.05),低于shRNA-SOX2-OT-1 细胞(P<0.05),对照细胞、shRNA-NC 细胞 Bcl-2 蛋白表达无统计学意义(P>0.05),均高于shRNA-SOX2-OT-1细胞(P<0.05);⑤双荧光素酶报告基因检测结果表明:SOX2-OT+miR-654 NC细胞与SOX2-OT+miR-654mimic 细胞中 3,UTR-MUT 水平无统计学意义(P>0.05);SOX2-OT+miR-654 NC 细胞 3’UTR-WT 水平高于 SOX2-OT+miR-654mimic 细胞(P<0.05);对照组细胞及shRNA-NC细胞中miR-654表达水平无统计学意义(P>0.05),均低于 shRNA-SOX2-OT-1 细胞(P<0.05);⑥shRNA miR-654 inhibitor 共转染结果表明:shRNA-SOX2-OT-1 与shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC细胞miR-654表达水平、细胞凋亡水平无统计学意义(P>0.05),均高于 shRNA-SOX2-OT-1+miR-654 inhibitor 细胞(P<0.05)。三种细胞在0h时间点细胞增殖水平均无统计学意义(P>0.05),随着时间的延长三种细胞增殖水平得到提高。shRNA-SOX2-OT-1+miR-654 inhibitor细胞24h、48h及 72h细胞增殖率均高于 shRNA-SOX2-OT-1 与 shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC细胞(P<0.05);shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC 与 shRNA-SOX2-OT-1 细胞,24h、48h及72h细胞增殖率无统计学意义(P>0.05)。Western blot测定凋亡相关蛋白结果表明:shRNA-SOX2-OT-1与shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC 细胞中凋亡蛋白 Bax,cleaved caspase3 表达水平无统计学意义(P>0.05),明显高于 shRNA-SOX2-OT-1+miR-654 inhibitor 细胞(P<0.05);shRNA-SOX2-OT-1 与 shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC 细胞中 bcl-2 蛋白表达水平无统计学意义(P>0.05),明显低于shRNA-SOX2-OT-1+miR-654 inhibitor 细胞(P<0.05)。流式细胞仪检测显示:shRNA-SOX2-OT-1 与 shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC细胞凋亡比率无统计学意义(P>0.05);shRNA-SOX2-OT-1+miR-654 inhibitor细胞凋亡比率明显低于shRNA-SOX2-OT-1与shRNA-SOX2-OT-1+miR-NC细胞(P<0.05)。结论(1)LncRNA SOX2-OT在喉鳞状细胞癌细胞中呈高表达,能直接参与喉癌的发生、发展,有望成为喉癌新的治疗靶点;(2)利用Lipofectamine2000转染,构建shRNA对LncRNASOX2-OT的表达进行干扰,能抑制喉癌细胞活性,削弱细胞的侵袭、转移能力,可降低细胞增殖及迁移相关蛋白表达,促进细胞凋亡;(3)LncRNA SOX2-OT能通过特异性作用吸附miR-654调控喉癌细胞的增殖与凋亡,能作为喉癌潜在的生物学标志物。