第一部分根皮苷对db/db小鼠糖尿病心肌病变保护机制的定量蛋白质组学研究研究背景糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种由于胰岛素绝对或相对分泌不足而导致的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的一种常见内分泌代谢性疾病。近年来,DM的发病率和患病率在全球范围内呈现逐年升高的趋势,已成为严重威胁人类健康与生活质量的世界性公告卫生问题。DM不仅仅表现为长期慢性的血糖升高,还可伴有多种并发症。其中心血管并发症已经成为DM并发症中致残率和致死率最高、危害最大的并发症。糖尿病性心脏病是糖尿病患者致死的主要原因之一,尤其是在2型糖尿病患者中。广义的糖尿病心脏病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病),糖尿病心肌病变和糖尿病心脏自主神经病变等。糖尿病心脏病与非糖尿病患者相比常起病比较早,糖尿病患者伴冠心病常表现为无痛性心肌梗死,梗死面积比较大,穿壁梗死多,病情多比较严重,预后比较差,病死率较高；如冠状动脉造影和临床排除冠状动脉病变,糖尿病患者出现严重的心律失常心脏肥大肺淤血和充血性心力衰竭,尤其是难治性心力衰竭临床可考虑糖尿病心肌病(Diabetic Cardimyopathy, DCM)。DCM是指发生在DM中,不能用高血压性心脏病、冠心病、心脏瓣膜病及其他心脏病来解释的心肌疾病。这一疾病在代谢紊乱及微血管病变的基础上引发心肌广泛灶性坏死,出现亚临床心功能异常,最终进展为心律失常、心力衰竭及心源性休克。迄今为止,针对糖尿病引起的心肌损伤目前尚无特效疗法,临床治疗首先是控制DM,然后主要针对心肌损害、心律失常、心力衰竭和抗血栓进行治疗。而且由于部分患者早期并无明显症状,而上述治疗方法均存在一定局限性,并不能有效及时的阻止它的的发展。因此,在临床实践中迫切需要寻找能有效防治糖尿病心肌病变的新型药物与途径,进一步完善与充实糖尿病心肌病变的治疗策略。根皮苷(phlorizin, PHL)是根皮素(phloretin)的2’-β-D-葡萄糖苷,是从苹果,苹果树皮及叶中提取的一种二氢查尔酮苷。大量研究表明,PHL具有多种生物活性与药理作用,如调节血糖、抗炎、抗肿瘤、改善认知以及抗氧化等等,目前已被应用于医药、化妆品、食品等领域。近年来,PHL作为新型药物在防治DM及其并发症中的作用获得广泛关注。动物实验发现,长期口服PHL对DM并发症的靶器官如肾脏、心脏、大动脉和视网膜的病变都起到显著地保护和改善作用。虽然临床研究已经证实了PHL对于DM患者心脏的保护作用,但是PHL对糖尿病心肌病变的改善及其保护作用的可能机制,目前国内外鲜见报道；PHL治疗糖尿病心肌病变的作用分子靶点也尚未明确。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术,具有良好的定量效果、较高的重复性,并可对多达四种不同样本同时进行定量分析。目前,iTRAQ技术已经在蛋白质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用。但是,国内外尚无报道采用iTRAQ标记及相关分析技术来研究根皮苷对2型糖尿病心肌损伤的保护机制。因此,在本研究中,我们应用了目前较为普遍认可的db/db小鼠的2型DM动物模型,通过10周的PHL灌胃,观察PHL对于db/db小鼠体重、血糖、血脂、血胆固醇及血中AGEs水平的影响,并对db/db小鼠的心脏进行了组织病理学和超微结构的形态学观察,旨在观察天然药物PHL治疗对于db/db小鼠体重、DM有关代谢指标的影响及其对心脏的保护作用,为临床治疗糖尿病性心脏病提供新的治疗思路与途径。另外,我们还应用了iTRAQ蛋白质组学定量技术,Turbo SEQUEST软件和国际蛋白质索引(international protein index, IPI)数据库检索等生物信息学方法,分离与鉴定正常对照组(CC组),db/db小鼠组(DM组)与db/db小鼠PHL治疗组(DMT组)等小鼠心肌组织的差异表达蛋白,旨在揭示PHL对于db/db小鼠糖尿病心肌病变变的分子保护机制,为开展药物研发工作寻找新的药物靶标开辟新途径,为临治疗提供新的思路。研究目的1.研究db/db小鼠在糖尿病进展中体重及有关代谢指标的变化,通过对db/db小鼠的心脏组织病理学和超微结构的形态学观察,评价糖尿病心肌病变的特征与程度。初步探讨db/db小鼠糖尿病心肌病变的差异表达蛋白的特征,进一步了解糖尿病心肌病变的分子机制。2.研究PHL对db/db小鼠体重及糖尿病有关代谢指标的变化的影响,通过对db/db小鼠的心脏组织病理学和超微结构的形态学观察,评价PHL对糖尿病心肌病变的保护作用。探讨db/db小鼠经PHL治疗后心肌组织的差异表达蛋白,根据其所参与的生物过程和代谢通路筛选出药物作用的关键蛋白与候选靶标,进一步揭示PHL对于糖尿病心肌病变的保护机制,为临床治疗提供新的理论基础。研究方法7周龄的雄性C57BLKS/J db/db小鼠16只,以及7周龄雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只。小鼠均予观察1周后开始正式实验。用C57BLKS/J db/m小鼠8只作为正常对照组(CC),C57BLKS/J db/db小鼠分为两组：一组随机8只小鼠为DM模型组(DM),每日用生理盐水灌胃；另一组随机8只为PHL干预组(DMT),每日用体积相同生理盐水的20mg/kg/d的PHL溶液灌胃,干预时间为10周。实验期间每周定期测量每只小鼠的体重并记录。实验结束时,所有小鼠空腹过夜并处死,采血检测空腹血糖(FBG),血甘油三酯(TG),血总胆固醇(TC)及血清糖基化终末代谢产物(AGES)等指标；并迅速分离心脏组织,按照病理取材常规制作心肌石蜡切片。剩余心脏组织分离后立即存于液氮-80℃保存留待进步蛋白质组学实验用。从正常对照组(CC组),db/db小鼠组(DM组)与db/db小鼠PHL治疗组(DMT组)三组小鼠中各选取4只,分离心脏。每只小鼠取50mg心脏组织,进行心肌组织研磨、切碎、超声破碎、裂解来提取心肌总蛋白。各组取60ug肽段消化后用iTRAQ染料进行标记,正常对照组用114标记,PHL干预组用116标记,db/db糖尿病组用117则标记。将各组已标记的肽段混合,用强阳离子交换柱(strong cation exchange, SCX)进行分离分级,收集穿流以及洗脱部分合并成10组。接下来用Thermo Finnigan LTQ Velos质谱仪进行液相质谱-串联质谱分析(LC-ESI-MS/MS)。最后,使用相关软件将定量及检定结果进行合并处理,得到定量和鉴定结果。搜索使用的数据库为ipi.MOUSE.v3.72.REVERSED.fasta蛋白库(Sequest结果过滤参数为：Protein FDR<0.01; Peptide FDR<0.01),应用EXPASY蛋白质组学工具来分析等电点、分子量等。然后采用Ingenuity Pathway Analysis软件(www.ingenuity.com)对经鉴定的心肌蛋白质进行蛋白功能和通路的分析。最后将筛选出的部分差异蛋白用蛋白质免疫印迹方法(Western blot)进一步验证其在心肌组织中的表达。研究结果1.一般观察CC组小鼠生长良好,精神状况佳,毛发光亮顺泽,活跃。DM组小鼠在实验进程中,逐渐表现为毛发污秽无光泽,被毛蓬松,少动,出现明显的多饮、多食、多尿,体重迅速增加。而DMT组小鼠的上述表现较DM组有所减轻。2.PHL对db/d小鼠体重、FBG、TG、TC与AGEs的影响随着观察时间的延长,DM组与DMT组小鼠的体重较对照组呈显著增加。从实验第2周开始,DM组小鼠体重逐渐增加,一直持续到实验结束的第10周(P<0.05)。然而,DMT组小鼠与DM组相比,PHL灌胃显著改善了DM小鼠体重的快速增加(P<0.05)。实验开始时,各组小鼠的血FBG、TG、TC及AGES水平无明显差异。至实验结束时DM组小鼠的FBG、TG、TC及AGES水平与CC组比较,均明显升高(P<0.05)。给予PHL干预的DMT组小鼠的FBG、TG、TC及与AGES水平与DM组比较则明显下降(P<0.05)。3.PHL对db/db小鼠心肌组织病理学变化的影响实验结束后,将db/db小鼠心肌组织切片进行苏木素-伊红(HE)染色进行观察。DM组的小鼠的心肌组织较CC组呈现出明显的心肌细胞肥大和心肌细胞排列不规则,并伴有细胞核损伤。然而,DMT组经过PHL的治疗大大减少了心肌组织肥大以及细胞核损伤的情况。4.PHL对db/db小鼠心肌组织超微结构变化的影响通过电子显微镜下对db/db小鼠心肌组织超微结构的观察,发现CC组小鼠心肌细胞肌原纤维完整,排列整齐,线粒体结构正常,呈线性排列；细胞核形态良好,核膜完整。而DM组心肌细胞中可以观察到线粒体肿胀,嵴溶解,有很大区域的肌原纤维及线粒体排列混乱不规则；细胞核的形态有所改变,核膜不完整。然而,在DMT组,PHL的治疗明显的降低了心肌细胞中损伤的线粒体的数量,并且减轻了肌原纤维的不规则排列情况。5.iTRAQ鉴定结果经LS-ESI-MS/MS鉴定并予软件分析、数据库检索后,共鉴定出蛋白1627种,符合鉴定条件者可信蛋白1591中,具有唯一肽段7836个。其中鉴定在DM组与正常对照组心肌蛋白相比表达有变化但经PHL治疗后回调的差异表达蛋白共113个,其中在DM组表达上调的但经PHL治疗后回调的有29个,在DM组表达下调的但经PHL治疗后回调的有84个6.PHL干预后重要差异蛋白质特征在这些经PHL治疗后回调的差异表达蛋白中,我们发现一些涉及到糖尿病心肌病变发生发展的重要蛋白,并把它们按照功能和所参与的代谢过程分为：与心肌脂代谢有关的蛋白、与心肌线粒体有关的蛋白和与心肌病发生发展有关的蛋白,进一步明确这些重要蛋白在糖尿病心肌病变中的可能起的作用。7.PHL干预后差异蛋白的生物信息学分析对于PHL干预后的113个差异蛋白点,采用IPA软件对有显著改变的蛋白所参与的重要生物过程和疾病进行分析。结果发现,这些蛋白所参与的生物过程和疾病包括心血管疾病、脂代谢、心血管系统的发育和功能、内分泌系统疾病、自由基的修复和能量的产生等等,都是与糖尿病心肌病变的发展密切相关的生物过程。对于PHL干预后的113个差异蛋白点,采用IPA软件绘制差异蛋白功能网络来说明这些蛋白之间的相互关系。网络中共出现35个蛋白,其中有24个蛋白是我们筛选出的重要的差异蛋白,比如Dapk3, Titin, Prkaa, Des, ILK, Nampt等。此蛋白相互作用网络为我们进一步研究脂质代谢、线粒体功能和心肌病的发生和发展之间的关系提供了新的思路。8.筛选的差异蛋白在心肌组织的表达改变为了验证蛋白质组学鉴定出的部分差异蛋白在心肌组织的表达,应用Western blot方法检测其中差异蛋白如钙联蛋白(Calnexin)与整合素连接激酶(integrin-linked protein kinase,ILK)在各组小鼠心肌组织中的表达。结果显示,与在正常对照组小鼠心肌中的表达比较,Calnexin在db/db小鼠中表达明显增高,然而PHL治疗后,表达增高的Calnexin有所下调。另外,ILK在db/db小鼠中表达中与正常对照组比较表达后明显降低,经过PHL干预后该蛋白表达回调。经过VisionWorks LS image acquisition and analysis software软件分析亦显示该蛋白质印迹实验结果与iTRAQ鉴定结果是一致的。结论1.与正常对照组比较,db/db小鼠随年龄增长体重显著增加,血FBG、TG、TC及AGEs水平显著升高；PHL灌胃干预可以明显抑制db/db小鼠的肥胖趋势,并且能够显著降低其FBG、TG、TC及与AGEs水平。说明PHL可能通过改善db/db小鼠的糖尿病整体代谢紊乱状态来预防DM的进展和并发症的发生2.心肌组织的形态学观察显示,PHL治疗可以明显改善db/db小鼠心肌组织肥大以及细胞核损伤的情况；而且,PHL治疗明显减轻db/db小鼠心肌细胞中肌原纤维的不规则排列情况,降低损伤的线粒体的数量。说明PHL对db/db小鼠的糖尿病心肌病变具有保护作用。3.作为定量蛋白质组学的新技术,iTRAQ具有高灵敏性、高通量,良好的定量效果、较高的重复性,能够对于多组样本同时进行比较分析以便获得更好的蛋白质组覆盖率。所以,iTRAQ能够用于研究PHL对db/db小鼠糖尿病心肌病变保护作用的分子机制,帮助发现新的药物靶标。4.应用LS-ESI-MS/MS鉴定得到db/db小鼠组与正常对照组心肌蛋白相比表达有变化但经PHL治疗后回调的差异表达蛋白共113个,其中在DM组表达上调的但经PHL治疗后回调的有29个,在DM组下调的但经PHL治疗后回调的有84个。采用IPA分析发现这些蛋白参与的生物过程和疾病涉及到心血管疾病、脂代谢、心血管系统的发育和功能、内分泌系统疾病、自由基的修复和能量的产生等等,提示这些过程可能与糖尿病心肌病变的发生与发展密切相关。第二部分质膜微囊的脂肪酸组成和小窝蛋白-1的脂肪酸化的研究研究背景质膜微囊(Caveolea),是一种特殊类型的脂筏,是哺乳动物细胞质膜上呈细颈烧瓶状的内陷结构,内含丰富的胆固醇、鞘磷脂和鞘糖脂。质膜微囊大量存在于内皮细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞和肺上皮细胞,参与许多细胞生命活动,细胞内吞、胆固醇运输、细胞膜组装、信号传导和肿瘤生成。小窝蛋白(caveolin)是质膜微囊区别于其它脂筏结构的特征性蛋白分子,它与信号传导、物质转运、细胞增殖等密切相关,维持着质膜微囊的结构和功能。Caveolin-1能与多种信号分子如G蛋白α亚基、酪氨酸激酶受体、PKCs、Src家族酪氨酸激酶和eNOS相互作用。生物体内小窝蛋白异常可以引起多种疾病或异常。除了富含胆固醇和鞘磷脂,caveolea内也含有多种脂肪酸。一般认为,大多数细胞的蛋白质脂肪酸化是以共价键形式与肉豆蔻酸(C14：0)和／或棕榈酸(C16：0)结合,并且蛋白质的脂肪酸化对其在细胞膜上的定位十分重要。从目前国内外的研究情况来看,虽然caveolea的结构成分已经较为清楚,但是对于其所含脂肪酸的种类组成与绝对定量的研究并不多见；此外,目前对于caveolea内的许多蛋白质(如eNOS)的脂肪酸化及功能研究报道诸多,但是作为caveolea的支架蛋白,有关caveolin-1的脂肪酸化及其在caveolea上定位的影响却报道甚少。在本研究中,我们采用了气相色谱-质谱技术(GC/MS)来定性和定量中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中脂肪酸、caveolea内含有的脂肪酸和以共价键形式结合在caveolin-1上的脂肪酸,并用同位素标记的脂肪酸验证了caveolin-1的脂肪酸化,以及观察了caveolin-1的脂肪酸化对其在caveolae上的定位是否有影响,旨在明确特定脂肪酸与caveolea、caveolin-1的关系,为日后研究某种特定脂肪酸对蛋白质的酸化作用奠定理论基础。研究目的1.采用气相色谱-质谱技术(GC/MS)对CHO细胞中脂肪酸、caveolea内含有的脂肪酸和以共价键形式结合在caveolin-1上的脂肪酸来进行定性和定量,旨在明确其相关脂肪酸组成及含量。2.采用同位素标记的脂肪酸,通过观察与非标记脂肪酸竞争性结合caveolin-1,来验证caveolin-1的脂肪酸化的种类。3.通过将CHO细胞培养在含有或不含有特定脂肪酸的环境中,观察caveolin-1的脂肪酸化对其在caveolae上的定位是否有影响。研究方法中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在10cm的培养盘中使用Ham’s F-12培养基(含5%的FBS,2mmol/L的L-谷氨酰胺,100U/mL的青霉素和100μg/ml的链霉素)培养至90%融合,用冷的PBS洗5遍后溶解于1mlMBST/OG(含25mM的MES,150mM NaCl,1%Triton-100,60mM心肌糖苷,PH=6.7),在冰上放置30分钟。使用Op ti-prep的方法将质膜微囊(caveolea)、细胞质(cytosol)、质膜(plasma membrane)、内膜(internal membrane)和去核后上清液(post nuclear supematan, PNS)分离。为了提取用于脂肪酸定量的caveolin-1,CHO细胞的裂解液中加入抗caveolin-1IgG在4。C孵育18小时,然后用蛋白A磁珠孵育另外2小时。离心,收集珠子,然后使用高盐缓冲液(500mM NaCl)洗5次。用于定量分析的脂肪酸珠子用1M的NaOH孵育过夜,然后用1M HC1中和,再用Folch试剂(氯仿：甲醇=2：1)提取脂质,并用GC/MS分析。非免疫兔IgG被用作阴性对照。用GC/MS对脂肪酸进行定量方法是：用Folch/BHT试剂来提取样本中的脂质,50μl的二十三烷酸(23：0)(5mg/ml的氯仿)加入提取液中作为内参。然后样本中全部的脂质用BF3/甲醛(10%)进行甲基脂化。用装有omegawax250毛细管柱的气相色谱系统(Agilent6890GC G2579A)来分析脂肪酸甲基脂。大型选择性探头(MSD, Agilent5973)用来识别目标峰,氢火焰离子化检测器(FID)用于定量脂肪酸。蛋白质印迹方法原理与步骤同第一部分。一抗为抗caveolin-1IgG多克隆抗体(滴度1：200,Sigma. USA)。为了测定Caveolin-1的脂肪酸化,CHO细胞在10cm培养皿中使用Ham’s F-12培养基中培养至80%融合(含5%的FBS,2mmol/L的L-谷氨酰胺,100U/mL的青霉索和100μg/ml的链霉素)。使用含1%BSA的培养基饥饿细胞十八小时后,用2.5mCi的3H棕榈酸(3H-C16：0)或者25μCi的14C硬脂酸(14C-C18：0)在有／无30倍浓度的非标记棕榈酸和硬质酸的培养基中室温标记3小时。将细胞溶解于MBST/OG缓冲液,用抗caveolin-1蛋白A免疫沉淀。非免疫兔IgG被用作阴性对照。免疫沉淀下来的caveolin-1用SDS-PAGE分离,转移到PVDF膜上,caveolin-1的脂肪酸化用自动放射性监测仪检测在-80℃存放6周,用Kodak MS胶卷显影。研究结果1.CHO细胞中FA的含量及组成通过用GC/MS检测CHO全细胞裂解液中的脂肪酸的种类及含量,我们发现CHO细胞中含有多种脂肪酸,包括饱和与不饱和脂肪。在这些脂肪酸中油酸占了高达59.5%的比例(C18:1,307±18.4μg/5×107cells),其次是棕榈酸(C16:0,91.8±9.5μg/5x107cells;17.8%)),硬脂酸(C18:0,51.8±10.2μg/5×107cells;10%)),鳕油酸(C20:1,22.5±1.4μg/5×107cells;4.4%),棕榈油酸(C16:1,18.7±1.1μg/5x107cells；3.6%),花生四烯酸(C20:4,14.8±1.8μg/5×107cells;2.9%)和肉豆蔻酸(C14:0,9.0±1.4μg/5×107cells;1.7%).2Caveolae中FA的含量及组成通过用GC/MS检测caveolea中脂肪酸的含量与组成,我们发现caveolea中含有有限的几种脂肪酸,主要为棕榈酸(C16:0,0.48±0.06μg/5×107cells;24%),硬脂酸(C18:0,0.61±0.07μg/5×107cells;30%)和油酸(C18:1,0.83±0.21μg/5x107cells;40%)。3.与Caveolin-1结合的FA的含量及组成一般认为,质膜蛋白会容易被肉豆蔻酸(C14：0)和棕榈酸(C16：0)所脂肪酸化。然而通过用GC/MS检测与caveolin-1结合的脂肪酸含量与组成,我们发现约60%的与caveolin-1结合的脂肪酸为硬脂酸(C18：0),40%的为棕榈酸(C16：0)。我们并没有没有检测到任何的肉豆蔻酸(C14：0)与CHO细胞的caveolin-1相结合。4.测定Caveolin-1的脂肪酸化为了进一步验证结合于caveolin-1上的脂肪酸种类及相互作用,我们采用了同位素标记的脂肪酸来检测Caveolin-1脂肪酸化。结果显示,在用3H-棕榈酸(3H-C16：0)标记的细胞中,我们检测到了结合到caveolin-1上的大量3H-棕榈酸(3H-C16：0),说明棕榈酸可以直接与caveolin-1相结合。当有过量的非标记棕榈酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)存在时,非标记棕榈酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)有效的阻滞了3H-棕榈酸(3H-C16：0)与caveolin-1的结合。但是过量的非标记油酸(C18：1)只是轻度的阻滞了3H-棕榈酸(3H-C16：0)和caveolin-1的结合。同样的,在用14-硬脂酸(14C-C18:0)标记的细胞中,我们检测到了与caveolin-1结合的大量14-硬脂酸,说明硬脂酸可以直接与caveolin-1相结合。当有过量的非标记硬脂酸(C18：0)存在时,非标记硬脂酸(C18：0)能够有效地抑制14C-硬脂酸(14C-C18：0)与caveolin-1的结合。过量的非标记油酸(C18：1)和棕榈酸(C16：0)虽然也阻滞了14C-硬脂酸(14C-C18：0)与caveolin-1的结合,但是阻滞的效果较之非标记硬脂酸(C18：0)不明显。这些数据说明棕榈酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)可以直接结合于caveolin-1上,并且是其结合的主要脂肪酸。5.脂肪酸化对Caveolin-1亚细胞定位的影响蛋白质的脂肪酸化可以影响蛋白的亚细胞定位。为了检测caveolin-1的脂肪酸化是否影响了caveolin-1的亚细胞定位,我们把CHO细胞分别培养在含有20%FBS,1%BSA,1%BSA+棕榈酸(过量)和1%BSA+硬脂酸(过量)培养基中。结果显示,caveolin-1在caveolea上的定位在20%FBS与1%BSA培养基中没有明显差别,在加入和不加入过量棕榈酸或硬脂酸培养基也未见明显差别。说明棕榈酸和硬脂酸对于caveolin-1在caveolea上的定位没有明显影响。结论Caveolea含有有限种类的部分脂肪酸,其中饱和脂肪酸的含量较高,这与CHO全细胞中脂肪酸的组成有所不同。与caveolin-1结合的最主要脂肪酸是硬脂酸,而不是之前推测的肉豆蔻酸。Caveolea独特的脂肪酸结构和caveolin-1的脂肪酸化可能对于caveolea的形成和维持其功能非常重要。对这些相关脂肪酸的定性和定量研究将会对进一步揭示Caveolea的功能和caveolin-1的脂肪酸化对于细胞膜信号传导所起的作用有重要的意义。