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目的肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101, TSG101)是1996年在NIH3T3鼠成纤维细胞中发现的。TSG101蛋白介导了多种生物学功能,如调控囊泡运输、细胞周期等,在多种类型的人类恶性肿瘤中存在异常表达,但其与肿瘤发生的关系尚未完全阐明。细胞外信号调节激酶(extra cellular signal-regulated protein kinase, ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase, MAPK)家族的经典转导通路之一,在促进细胞的增殖、分化及抑制细胞凋亡中发挥重要作用。低氧诱导因子-1a(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是一种低氧条件下诱导产生的转录因子,在多效性低氧应答中发挥关键作用。有研究显示TSG101在转基因小鼠乳腺中的过表达导致了MAPK/ERK信号通路的异常激活。另有研究表明多种因素均可以通过激活MAPK/ERK信号途径来介导HIF-1α的产生。而迄今为止,在人类乳腺癌中,这些分子的相关调控作用如何尚不清楚。因此,本研究采用靶向TSG101的siRNA方法特异性下调了乳腺癌细胞系中TSG101蛋白的表达,观察TSG101的下调对乳腺癌细胞系生物学特性的影响,同时检测了人乳腺癌组织中三者的表达及相关性,探讨了TSG101与HIF-1α、MAPK/ERK信号通路的关系。实验材料与方法1、应用脂质体法将靶向TSG101的siRNA转染入人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中。以未转染的MCF-7细胞及转染普适型阴性对照siRNA (siRNA NC)的MCF-7细胞作为阴性对照。MTT比色法：1×103个／孔的细胞数分别接种转染组和对照组细胞于96孔细胞培养板内,酶标仪机检前加／入MTT培养细胞4小时,DMSO溶解沉淀颗粒,连续4天检测各组细胞的吸光度值,检测细胞增殖能力。细胞周期检测：分别收集TSG101 siRNA转染后72小时的MCF-7细胞和对照组细胞,70%乙醇4℃固定,将细胞密度调整至1×106／ml,PI染色后,流式细胞仪检测细胞周期变化,Modfit LTV3.0软件分析结果。细胞凋亡检测：分别收集TSG101 siRNA转染后72小时的MCF-7细胞和对照组细胞,以binding buffer重悬细胞,调整细胞密度为1×106／ml,加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液,流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。细胞迁移能力检测(transwell小室法)：分别收集TSG101 siRNA转染后48小时的MCF-7细胞和对照组细胞,接种到含有微孔滤膜的transwell小室,37℃、5%C02培养24小时后,95%乙醇固定,胎盘蓝染色,显微镜下观察细胞迁移能力的改变情况。免疫荧光：分别取TSG101 siRNA转染后72小时的MCF-7细胞爬片和对照组细胞爬片,4%多聚甲醛固定,Triton X-100处理,BSA封闭后,分别滴加HIF-1α、p-ERK一抗,4℃孵育过夜。避光加FITC标记二抗,激光共聚焦扫描显微镜观察,检测TSG101下调前后HIF-1α、p-ERK蛋白的变化。Western blot:分别提取转染组和对照组细胞蛋白,采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取等量蛋白,进行SDS-PAGE凝胶电泳和转印,分别加入TSG101、HIF-1α、ERK1/2、p-ERK一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗孵育后ECL发光。以(3-actin作为内对照。检测TSG101 siRNA后MCF-7细胞中TSG101、HIF-1α、ERK1/2和p-ERK蛋白的表达。2、本研究采用54例乳腺癌组织标本,均来自中国医科大学第一临床学院2004年-2005年行外科切除手术的乳腺癌患者,所有患者术前均未接受过放疗、化疗。标本经4%甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,经脱蜡,脱苯,水化后,采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P)法检测ITSG101、HIF-1α、和p-ERK蛋白表达,以PBS代替一抗作为阴性对照,以已知阳性乳腺癌切片作为阳性对照。结果判定：以细胞浆和(或)细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片随机选取5个高倍视野,每个视野计数200个肿瘤细胞,共计1000个细胞。首先按染色强度评分：无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分；再按阳性细胞所占百分比评分：阴性为0分,阳性细胞数≤10%为1分,11%-50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分；最后按二者乘积分数≥3定为阳性,<3为阴性。3、应用SPSS13.0统计分析软件进行数据处理,以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1、使用Western blot方法,应用抗TSG101单克隆抗体检测,在45KD处可见特异性染色条带。以β-actin作内参照,对Western blot结果进行灰度测定和分析,发现TSG101 siRNA组的细胞TSG101蛋白相对表达量(0.1338±0.0086,0.0708±0.0091)与对照组(0.5460±0.0145,0.4782±0.6778)相比明显降低(P<0.05)。2、TSG101 siRNA转染后,细胞增殖能力减弱,细胞凋亡率增加,细胞周期阻滞。MTT法检测结果表明,TSG101 siRNA组的细胞增殖能力明显低于对照组细胞(P<0.05)。流式细胞仪检测发现,TSG101 siRNA组的细胞凋亡率增加,为13.71±1.31%,与对照组相比(4.37±0.87%,6.00±0.08%),差异有统计学意义(P<0.01)。细胞周期检测显示,TSG101 siRNA组细胞Go／G1期比例(70.51±0.23%)与对照组(59.15±0.77%,59.21±0.68%)相比明显增多(P<0.01)；S期细胞(23.65±0.78%)与对照组(34.96±0.45%,34.89±0.30%)相比明显减少(P<0.01)。3、TSG101 siRNA转染后,细胞迁移能力减弱。transwell小室检测细胞迁移能力实验发现,TSG101 siRNA组的细胞迁移数(4.60±0.80)与对照组(24.47±1.90,23.80±2.20)相比差异有统计学意义(P<0.01)。4、TSG101 siRNA转染后,HIF-1α和p-ERK蛋白表达减少。免疫荧光染色结果可见,TSG101 siRNA转染后,细胞HIF-1α和p-ERK蛋白染色强度与对照组相比明显减弱。Western blot结果显示,TSG101 siRNA转染后,HIF-1α蛋白相对表达量(0.1235±0.0057)与对照组(0.6762±0.0080)相比,明显减少(P<0.01); TSG101 siRNA转染后,p-ERK蛋白相对表达量(0.1582±0.0093)与对照组(0.5078±0.0036)相比明显减少(P<0.01)。5、免疫组化结果显示,TSG101、HIF-la和p-ERK蛋白主要定位于乳腺癌细胞浆和(或)细胞核内,呈棕黄色颗粒,阳性率分别为74.07%(40／54)、77.78%(42／54)、81.48%(44／54)。统计学分析显示,TSG101和HIF-1α在乳腺癌中的蛋白表达存在正相关(P<0.05)；TSG101和p-ERK在乳腺癌中的蛋白表达存在正相关(P<0.05)。结论1、TSG101的下调能够抑制乳腺癌细胞增殖,诱导乳腺癌细胞凋亡,阻滞乳腺癌细胞周期于G1／S期,并降低其迁移能力。2、TSG101和HIF-1α在乳腺癌组织中的蛋白表达存在正相关,并且TSG101的下调能够减少乳腺癌细胞中HIF-1α蛋白的表达,提示TSG101在乳腺癌中可能对HIF-1α的基因表达和转录活性具有调节作用。3、TSG101和p-ERK在乳腺癌组织中的蛋白表达存在正相关,并且TSG101的下调能够减少乳腺癌细胞中p-ERK蛋白的表达,提示TSG101在乳腺癌中可能通过MAPK/ERK信号通路发挥生物学作用。