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核糖体蛋白L32(ribosome protein L32)是一种在动物、植物和酵母等不同生物类群中普遍存在的蛋白,其进化上相对保守。大多数真核生物的核糖体蛋白L32仅由一个基因编码,而粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32由两个基因编码,表达的蛋白质分别是L32-1和L32-2。本实验室前期已对132-2基因进行了克隆表达,并对其功能进行了研究,表明其可能是一种潜在的转录调控因子。由于核糖体蛋白L32-1和L32-2的氨基酸序列相似度极高,为96.85%,为了更深入地研究和确定粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和L32-2的功能,本文首先构建了132基因的敲除和过表达酵母菌株,并对这些菌株的生长特性进行了研究。本文首先提取了野生型粟酒裂殖酵母Sohizosacchharomyces pombe的基因组DNA,通过PCR反应扩增得到编码核糖体蛋白L32-1的基因132-1,将其连接到pMD18-T载体上,用双酶切连接的方法将其连入酵母表达载体pESP-3,构建质粒pESP-3/ι32-1,醋酸锂法转化SP-QO1菌株,构建过表达菌株SP-QO1(pESP-3/ι32-1).另外,本实验室前期研究中已成功构建过表达菌株SP-Q01(pESP-3/ι32-2).本文还成功构建了敲除132基因的酵母菌株。通过设计三对引物,两轮over-lapPCR反应获得含有132基因上下游同源臂的融合片段,将其导入SP-Q01菌株,通过同源置换原理,G418抗性筛选,最终成功构建了敲除菌株SP-Q01(Δι32-1)和SP-Q0l(△132-2)的突变株。同时,在敲除菌的基础上,我们回补了相关基因,得到了基因回补菌株SP-Q01(Δι32-1,pESP-3/ι32-1).SP-Q01(Δι32-1,pESP-3/ι32-2).SP-Q01 (△ι32-2,pESP-3/ι32-1).SP-Q01(△ι32-2,pESP-3/ι32-2)。最后,本文对132基因的敲除或过表达菌株的生长特性进行了研究。测定其生长曲线发现,132-1基因的过表达菌株的生长速度最慢；形态观察发现,敲除132基因的酵母菌株SP-Q01(△ι32-1)和SP-Q01(△ι32-2)出现凝絮现象,过表达132基因的菌株SP-Q01(pESP-3/ι32-1)和SP-Q01(pESP-3/ι32-2)出现了个体形态变长的细胞。具体的机制有待继续研究探讨。