鼻咽癌是我国南方常见肿瘤，约69.5％的鼻咽癌患者就诊时已属中晚期，这部分患者以及对放射线不敏感的病人放射治疗效果不理想。全身化疗副作用大。尽管采用了以放疗和化疗等综合治疗措施，鼻咽癌总的5年生存率仍较低，在50％左右，基因治疗开辟了恶性肿瘤治疗的新途径。　　 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)通过降解基底膜和细胞外基质等促进肿瘤浸润和转移，MMPs中的Ⅳ型胶原酶MMP-9与鼻咽癌等恶性肿瘤侵袭及转移关系极其密切。反义寡核昔酸(antisense oligonucleotides，ASODN)是一段与mRNA或DNA特异性结合，并阻断其表达，可特异性抑制肿瘤细胞增殖的人工合成分子。已有应用MMP-9-ASODN治疗恶性肿瘤的研究，但基因治疗的临床疗效并不理想，其主要原因缺乏靶向性强、转染效率高的基因载体。　　 在磁性纳米粒表面修饰特异性的单克隆抗体、配体等能使纳米粒子成为很好的靶向性载体，可将基因定向地传递到靶部位，通过这种主动靶向给药，既能提高基因的疗效，亦能降低毒副作用。其中，叶酸/叶酸受体(Folic acid，FA，Folatereceptor，FR)介导靶向传递成为该领域的热点。已经有很多研究发现叶酸受体在多种恶性肿瘤细胞表面高水平表达，而在正常细胞和组织几乎不表达叶酸受体。我们课题组前期研究也发现叶酸受体在85％的鼻咽癌组织和HNE-1细胞株高表达，并成功制备了连接叶酸的磁性纳米药物载体。　　 因此我们拟构建一种叶酸分子靶向的载MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物(FA-MNP-MMP-9-ASODN)，并通过体内外靶向性实验、治疗效应评估这种分子靶向磁性纳米复合物治疗鼻咽癌的可行性。本实验研究分三部分，摘要如下：　　 第一部分基质金属蛋白酶9与鼻咽癌浸润转移关系的实验研究　　 目的：明确MMP-9在鼻咽癌细胞系、人鼻咽癌组织以及鼻咽癌不同细胞株裸鼠成瘤瘤块中的表达情况，探讨MMP-9的表达与鼻咽癌浸润转移的关系。　　 方法：采用免疫组化、RT-PCR、Western Blot检测鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE-2、HNE-1、HNE-2和SUNE-1五株细胞中MMP-9表达；免疫组化检测39例鼻咽癌和11例慢性鼻咽炎组织MMP-9的表达，分析鼻咽癌组织MMP-9表达与临床参数的关系；免疫组化检测HNE-1和CNE-2细胞裸鼠成瘤后瘤块MMP-9的表达。　　 结果：5株鼻咽癌细胞株中HNE-1和SUNE-1细胞免疫组化检测有MMP-9蛋白的表达，RT-PCR及Western Blot检测显示HNE-1和SUNE-1中有较强的MMP-9mRNA及蛋白的表达；27例鼻咽癌组织及3例慢性鼻咽炎组织MMP-9阳性表达，MMP-9在鼻咽癌组织中表达率(69.2％)明显高于慢性鼻咽炎(27.3％)，鼻咽癌组织中MMP-9蛋白的表达与颈部淋巴结转移相关；5例HNE-1及CNE-2瘤块MMP-9皆表达强阳性。　　 结论：鼻咽癌的浸润转移能力与MMP-9有关。　　 第二部分叶酸分子靶向载MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备及靶向性研究　　 目的：构建FA分子靶向载MMP-9-ASODN磁性纳米复合物。通过体内外实验，研究FA-MNP-MMP-9-ASODN对鼻咽癌叶酸受体的靶向能力。　　 方法：采用课题组制备的叶酸分子靶向磁性纳米载体，通过醛基与氨基缩合反应与MMP-9-ASODN偶联，制备携带MMP-9特异性寡核苷酸的分子靶向磁性纳米复合物(FA-MNP-MMP-9-ASODN)，使用紫外分光光谱检测该纳米复合物的叶酸成分及浓度；采用琼脂糖凝胶电泳分析寡核苷酸与载体的偶联。体外通过叶酸封闭实验、细胞铁染色、透射电镜观察HNE-1及CNE-2细胞吞噬FA-MNP-MMP-9-ASODN情况；体内实验通过同一裸鼠种植HNE-1及CNE-2两种瘤块的MR成像、种植瘤块铁染色及透射电镜观察，比较两种肿瘤组织吞噬FA-MNP-MMP-9-ASODN的差别。　　 结果：表征结果显示叶酸及MMP-9-ASODN已成功连接在磁性纳米载体上。体外实验铁染色发现FR阳性的HNE-1细胞对于FA-MNP-MMP-9-ASODN的摄取是通过FR途径实现的，具有浓度依赖性和竞争性，电镜观察证实了HNE-1细胞能有效摄取FA-MNP-MMP-9-ASODN。而FR阴性的CNE-2细胞不能有效的摄取FA-MNP-MMP-9-ASODN。裸鼠MR成像和瘤块铁染色及电镜观察发现HNE-1瘤块能有效的吞噬FA-MNP-MMP-9-ASODN。　　 结论：已成功构建FA分子靶向载MMP-9-ASODN磁性纳米复合物，并具有良好的稳定性及磁靶向特征。体内外实验证实FA-MNP-MMP-9-ASODN具有良好的分子靶向性。　　 第三部分叶酸分子靶向载MMP-9-ASODN磁性纳米复合物对鼻咽癌的抑制效应　　 目的：观察FA分子靶向磁性纳米载体细胞毒性及FA-MNP-MMP-9-ASODN对鼻咽癌的体内外抑制效应。　　 方法：应用MTT方法检测FA-MNP细胞毒性及转染FA-MNP-MMP-9-ASODN前后HNE-1细胞增殖能力的变化；采用流式细胞技术、Matrigel体外侵袭试验、RT-PCR及Western-blot方法观察转染前后HNE-1细胞周期、侵袭能力、MMP-9 mRNA及蛋白表达水平。体内实验观察FA-MNP-MMP-9-ASODN对裸鼠HNE-1移植瘤块的生长抑制效应。　　 结果：当铁的终浓度不超过44.13μg.ml-1时，该纳米载体对细胞没有毒性；转染FA-MNP-MMP-9-ASODN后HNE-1细胞MMP-9 mRNA及蛋白的表达水平显著受到抑制，增殖能力及侵袭力明显降低，流式细胞分析显示细胞周期受到抑制，细胞凋亡增加。荷瘤裸鼠体内实验发现FA-MNP-MMP-9-ASODN治疗后，瘤块体积和重量较对照组减小，但无统计学差异。　　 结论：FA-MNP-MMP-9-ASODN通过抑制MMP-9的表达，可降低鼻咽癌细胞的增殖和侵袭能力，体外抑制效果良好，但体内抑制效应不明显。