哺乳动物早期胚胎发育是由一系列高度保守、可调控、可预测的细胞分裂等事件构成的,主要包括:精卵结合形成受精卵、最初的胚胎细胞分裂(卵裂)、合子基因组激活(zygotic genome activation,ZGA),桑椹胚的致密化(compaction)和形成具有植入能力的囊胚(blastocyst)。其中单细胞的合子(zygote)迅速扩张分化形成含有多细胞谱系的囊胚对于早期胚胎发育过程至关重要。猪是重要的肉用家畜,也是潜在的生物医学模式动物和人类异种器官移植的供体动物。二十一世纪生命科学基础研究的发展迅猛,干细胞和基因编辑理论与技术不断取得突破。如何把这些前沿理论与技术成果早日应用在猪的育种、医学模型猪的构建及异种器官移植供体的研制中是该领域科学家面对的重要挑战。鉴于猪在疾病模型上的优势地位,更多的了解猪早期胚胎发育机制,以及突破猪干细胞建立的瓶颈是后续所有研究人员的重点工作。纵观小鼠ESC建立的过程,想要在其他大型哺乳动物上成功建立ESC还需要很长的探索之路,目前唯一能作为参考的只有早期胚胎,通过深度挖掘早期胚胎的发育机制能够为最终建立ESC提供强有力的理论支持,以便更好的推动猪作为疾病模型的探索工作。因此,借助新兴的技术手段来全面地解析猪早期胚胎的发育机制已迫在眉睫。与小鼠胚胎发育相比,猪胚胎着床前的发育时程长,胚胎发育的模式差别巨大,相关基础研究不多,可供参考的文献十分有限。过去,人们一直认为非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是转录的副产物,即“转录垃圾”,但是最近的一些研究已经证明,这些ncRNAs并不是“转录垃圾”,而是真正发挥功能的分子。此外ncRNAs分子的数量与有机体的复杂性相关,其对更加高等的动物可能会有更重要的作用。而且ncRNAs已被证明在各个物种中保守性比编码基因相对较弱,我们有理由怀疑ncRNAs会贡献到猪的特异性基因表达调控网络中。本研究借助于高通量转录组测序等先进分子技术,系统鉴定猪早期胚胎发育相关调控基因及ncRNAs(内源性小干扰RNA:endo-siRNAs;基因间长链非编码RNA:lincRNAs),并揭示猪作为大型哺乳动物代表的早期胚胎发育独特的分子调控网络。具体研究结果如下:(1)准备5×10~9个精子,7845个卵母细胞和6800个合子用于小RNA高通量测序,在猪的精子,卵母细胞和合子中分别获得了90431,244480和219971个sncRNAs。通过自己建立的生物信息学方法第一次在猪配子及合子中对ncRNAs进行分类,并鉴定了三种来源的endo-siRNAs:重复元件相关的内源性小RNA(TE-siRNAs),长发卡结构来源的内源性小RNA(Lhp-siRNAs)和mRNA自身回折互补来源的内源性小RNA(IC-siRNAs)。对合子和精子或卵母细胞之间的endo-siRNAs进行了差异表达分析,重点研究对象为合子高表达的endo-siRNAs。深入分析显示大部分高表达的endo-siRNAs被映射到猪L1逆转录转座子的ORF2和3’UTR区域,因此,我们将这些L1来源的特异性endo-siRNAs称为L1-siRNAs。通过多重序列比对及RACE的方法,找到L1对应的反义转录物:一个没有注释的长链非编码RNA(asL1)。L1 ORF2和asL1之间可以形成365bp的双链RNA结构,并证实了合子中高reads数的9个L1-siRNAs都映射到该区域。最后,通过干扰等实验手段,证实了L1-siRNAs通过抑制L1逆转录的活性来调控早期胚胎发育。这项工作可以证实丰富的endo-siRNAs在胚胎发育中的作用。(2)除人小鼠以外的大型哺乳动物的早期胚胎单细胞转录组图谱目前没有报道。因此我们针对猪体内早期胚胎单卵裂球进行转录组测序,首创了一种针对猪的内细胞团和滋养层完整分离体系及单个细胞分离体系。最终对猪早期胚胎各个时期的单卵裂球共106个样本进行转录组测序。通过生物信息学分析揭示了猪早期胚胎宏观转录图谱随着胚胎发育的进行而发生动态变化;确定了猪合子基因组激活发生在四细胞到八细胞时期;在桑椹胚中鉴定了73个参与调控卵裂球异质性的关键候选基因;通过加权基因共表达网络分析(WGCNA),鉴定早期胚胎特定发育时期对应的特异性基因表达调控网络;最后通过与人,小鼠,牛基因表达调控网络进行比较,揭示了相比于小鼠,猪等大动物的早期胚胎发育调控网络可能与小型动物存在巨大的差别,挖掘出来许多猪的未进行功能研究的新基因,这些新基因都贡献到猪等大型哺乳动物特异性基因表达调控网络中,加深了人们对其的认知。(3)由于猪的基因组注释不完整,且以往测序数据深度不够,无法挖掘出有功能但表达量很低的lncRNAs,导致猪lncRNAs的相关工作停滞不前。本研究中,我们利用10G数据量的测序深度,第一次在猪单个卵裂球中系统地预测了lncRNAs。利用非依赖序列注释的编码能力预测算法(CPAT,CNCI,PLEK)对候选转录本进行打分,共得到43303个转录本为最终的lincRNAs的转录本,对应着18515个lincRNAs基因座。本研究预测得到的lincRNAs数量非常庞大,可以为研究lincRNAs的学者提供一个真正可参考的猪早期胚胎lincRNAs数据库。此外对于lincRNAs来说,在四细胞期各个卵裂球就表现出了明显的表达异质性,也暗示了lincRNAs先于编码基因表达出现异质性,可能预示着lincRNAs可以参与调控编码基因,从而造成随后的编码基因在各个卵裂球表达的异质性。通过将lincRNAs与编码基因融合在一起进行WGCNA分析,我们得到许多发育各时期相关的lincRNAs,丰富了mRNA的表达调控网络。