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研究背景和目的:心脑血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因,严重威胁着人类生命健康。近年来,随着医疗器械的不断更新及临床介入医生手术技巧的不断提高,心脑血管疾病的介入治疗已成为心脑血管疾病治疗的重要而常规手段。过去20年来,经皮冠状动脉介入治疗虽然取得了飞速的发展,但支架植入引起的内皮损伤而导致的血管再狭窄(restenosis,RS)发生率仍接近10%,这严重影响了手术疗效及患者预后,并同时让患者及其家庭背负了沉重的经济及精神负担。因此,探讨RS的发病机制及治疗具有重要的临床及社会意义。研究表明,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的过度增殖和迁移以及炎症应在血管内皮损伤后的RS中扮演着重要的作用。斑蝥素(cantharidin,CA)是我国传统中药斑蝥的主要活性成分,其对包括肺癌、乳腺癌以及黑色素瘤等多种癌细胞的增殖和侵袭具有显著的抑制作用,其中在黑色素瘤细胞的研究中发现其发挥作用与抑制核转录因子κB(NF-κB)信号通路介导的炎症反应有关。因此,我们推测斑蝥素在血管内膜损伤后的RS中也可能具有抑制VSMCs增殖和迁移以及抑制炎症反应的作用。为了验证以上推测,本研究分两部分进行。第一部分,体外培养VSMCs,通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导其增殖、迁移和炎症反应,观察斑蝥素对LPS诱导的VSMCs增殖、迁移和炎症反应的作用以及对NF-κB信号通路的影响。第二部分,通过建立SD大鼠颈总动脉球囊损伤模型,探讨斑蝥素对血管损伤后再狭窄的影响及相关机制。方法:1.细胞实验部分:采用组织块贴壁法获取SD大鼠胸主动脉VSMCs,运用VSMCs表型标志蛋白(α-SM-actin)抗体免疫荧光染色鉴定细胞。用1mg/L的LPS体外诱导VSMCs增殖、迁移和炎症反应,以观察不同浓度CA对VSMCs增殖、迁移及炎症反应的影响。采用细胞计数试剂盒(CCK-8实验)检测CA对VSMCs活性的影响以及筛选LPS诱导VSMCs增殖、迁移及炎症反应的最佳使用浓度;运用CCK-8实验及流式细胞仪检测VSMCs增殖;伤口愈合实验和Transwell实验检测VSMCs迁移;Western blot检测总的核转录因子p65(NF-κB p65,T-p65)、磷酸化的NF-κB p65(P-p65)及核转录因子κB抑制蛋白(IκB-α)的表达水平;使用实时荧光定量PCR法(Q-PCR)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等炎性因子表达水平;并使用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6浓度。2.动物实验部分:采用PTCA球囊导管建立SD大鼠颈总动脉球囊损伤模型,SD大鼠随机分为假手术组、损伤组、斑蝥素(2mg/kg)组,各组于造模前1周开始腹腔注射给药,连续给药3周,术后分别于第3天、第14天取静脉血,使用ELISA法检测血液中TNF-α及IL-6的水平,术后第14天同时处死大鼠并取损伤颈动脉进行HE染色和免疫组织化学染色检测损伤血管内膜处NF-κB p65、TNF-α及IL-6的表达。结果:1.细胞实验部分:CCK-8实验显示,斑蝥素浓度在0-10μmol/L时VSMCs活性不受影响;LPS使用浓度为1mg/L时VSMCs增殖能力显著提高,但随着LPS浓度的进一步增加其增殖能力增速减慢。CCK-8实验检测细胞增殖活性结果表明,当LPS刺激后VSMCs增殖活性显著提高,而当加用斑蝥素处理后,其增殖活性随着斑蝥素浓度升高而降低(P<0.05)。流式细胞周期检测结果显示,经LPS刺激后VSMCs中S期细胞占比明显减少,而G2期细胞占比明显增多(P<0.01);而与LPS刺激组比较,当加用斑蝥素刺激后,S期细胞占比却显著增多(P<0.01),G2期细胞占比明显减少(P<0.05)。伤口愈合实验显示,与对照组比较,LPS刺激后VSMCs迁移率提高2.8倍(P<0.01);而加用斑蝥素处理后,随着斑蝥素浓度增加,细胞迁移率逐渐降低;使用2.5,5,10μmol/L斑蝥素处理后,与LPS组比较,细胞迁移率分别下降18.0%,45.5%,60.9%(P<0.01)。Transwell实验结果显示,与对照组比较,经LPS刺激后穿出小室的细胞数增加3.25倍(P<0.01);而加入2.5,5,10μmol/L斑蝥素处理后穿出小室的细胞数分别较LPS组减少20.8%,45.2%和74.8%(P<0.05)。Western blot结果显示,IκB-α在LPS刺激后其表达较对照组显著降低(P<0.01),而加入斑蝥素后其表达随着斑蝥素浓度的增加而升高(P<0.05);与对照组比较,P-p65水平在LPS作用后表达明显增加(P<0.05);而经斑蝥素处理后其表达呈浓度依赖性降低(P<0.05);而T-p65水平在经LPS诱导以及斑蝥素处理后其表达均未见明显改变(P>0.05)。Q-PCR结果显示,与对照组比较,经LPS诱导后,细胞内TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平显著升高(P<0.05);与LPS组比较,LPS+5μmol/L CA组和LPS+10μmol/L CA组TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均明显降低(P<0.05);另外与LPS+5μmol/L CA组比较,LPS+10μmol/L CA组TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平更低(P<0.05)。ELISA结果显示,与对照组比较,LPS刺激后细胞培养液中TNF-α、IL-6浓度均有明显升高(P<0.05),而LPS引起的TNF-α、IL-6浓度升高在斑蝥素处理后其浓度随着斑蝥素浓度的增加而降低(P<0.05)。2.动物实验部分:HE染色结果显示,与假手术组比较,损伤组血管内膜增生面积和内膜/中膜比值均显著增加(P<0.01);而斑蝥素组较损伤组血管内膜增生面积减少62.3%(P<0.01),内膜/中膜比值减少48.0%(P<0.01)。大鼠血清ELISA结果显示,无论是在术后3天,还是术后14天,与假手术组比较,损伤组大鼠血清中TNF-α和IL-6浓度均升高(P<0.01);与损伤组比较,斑蝥素组大鼠血清中TNF-α和IL-6浓度均明显降低(P<0.05);另外,在损伤组和斑蝥素组中,术后14天大鼠血清中TNF-α和IL-6浓度均较术后3天有所降低(P<0.05);而假手术组大鼠血清中TNF-α和IL-6浓度在术后3天和术后14天未见明显改变(P>0.05)。免疫组织化学染色结果显示,与损伤组比较,斑蝥素组血管增生内膜中NF-κB p65表达降低38.4%(P<0.01),TNF-α和IL-6的表达较损伤组分别降低56.3%和53.2%(P<0.05)。结论:斑蝥素对VSMCs过度增殖和迁移引起的血管再狭窄具有显著抑制作用,其机制至少部分与斑蝥素抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。