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目的:1.观察人慢性髓性白血病细胞系敏感株K562细胞和耐药株K562/A02细胞血管内皮生长因子（VEGF）基因及蛋白的表达情况;并构建针对人VEGF的特异性短发夹RNA（shRNA）干扰片段,通过脂质体2000将VEGF shRNA导入白血病耐药株K562/A02细胞,观察转染24h、48h及72h后耐药白血病细胞VEGF基因及蛋白表达的变化。2.观察白血病细胞VEGF下调后,耐药白血病细胞的生物学行为的变化,探讨VEGF shRNA对K562/A02细胞生物学行为的影响及其机制,并观察PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路在此过程中的作用。方法:1.采用逆转录多聚酶链反应（reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR）方法检测K562细胞和耐药株K562/A02细胞VEGF基因的表达情况,Western blotting法检测两株细胞VEGF蛋白的表达差异;并采用脂质体2000介导的方法将针对人VEGF基因的三个特异性shRNA及随机片段HK（VEGF shRNA1、VEGF shRNA2、VEGF shRNA、HK）转染入K562/A02细胞,采用RT-PCR和Westernblotting法分别检测转染24h、48h及72h后的这四组细胞和K562/A02细胞VEGF mRNA和蛋白的表达情况,选取对VEGF基因干扰效果佳的时间点进行后续实验,以未转染组（K562/A02）及转染随机片段组（HK）为对照组。2.采用苔盼兰拒染细胞直接计数法、四唑蓝比色法（MTT）和细胞周期测定分析VEGF shRNA对K562/A02细胞增殖的影响,Annexin V检测转染前后白血病细胞的凋亡情况,采用MTT法检测转染前后阿霉素对耐药白血病细胞的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)的变化,计算其增敏倍数,RT-PCR、流式细胞术和Western blotting检测转染前后白血病细胞耐药相关基因（MDR1、MRP1、topoⅡ）及其蛋白的表达变化,采用胞内罗丹明123（Rho123）潴留试验检测转染前后白血病细胞跨膜转运蛋白P-gp及MRP1的功能状态,采用免疫印迹法检测转染前后白血病细胞MAPK/ERK和PI3K/AKT信号传导通路的活化水平。结果:1.与敏感株K562细胞比较,耐药株K562/A02细胞VEGF基因的表达水平更高,两组细胞VEGF mRNA与β-actin的灰度比值分别为0.5 18±0.055、0.814±0.073（t=6.845,p<0.001）,具有显著的统计学差异;并且免疫印迹法显示类似的结果,K562/A02细胞VEGF蛋白的表达水平显著高于K562细胞。通过脂质体介导的方法将随机片段HK和VEGF shRNA转染入K562/A02细胞,共获5组细胞,依次为K562/A02、K562/A02-HK、K562/A02-VEGF shRNA1、K562/A02-VEGF shRNA2和K562/A02-VEGF shRNA3;转染24h、48h及72h后,RT-PCR结果显示:不同时间点随机片段HK组和未转染组细胞VEGFmRNA的表达均无差异,而转染VEGF shRNA的各组细胞VEGFmRNA的表达水平均低于HK组,其中转染VEGF shRNA2和VEGFshRNA3组与HK组比较均有统计学差异（p<0.05）,并且转染不同时间VEGF shRNA3对VEGF的抑制率分别为（29.6±1.1）%、（45.9±1.6）%和（43.2±1.5）%;Western blotting结果也显示:转染24h、48h及72h后,阳性转染组VEGF的蛋白条带强度均比未转染组和HK组减弱,其中以转染VEGF shRNA3组最明显,与PCR结果基本一致。说明VEGF shRNA的导入有效地抑制了目的基因的转录与蛋白的表达,并且以VEGF shRNA3的干扰效果最明显。2.细胞生长曲线提示,与对照组比较,阳性转染组细胞生长缓慢,细胞周期动力学分析显示阳性转染组G1期细胞增多,G2期与S期细胞显著减少（p<0.05）,提示VEGF的表达可能参与细胞增殖的调节。在小剂量As2O3作用下,未转染组无明显凋亡,HK组与阳性转染组细胞均出现凋亡,Annexin V检测结果显示:阳性转染组细胞的早期凋亡数量高于HK组和未转染组细胞,5组细胞的凋亡细胞率依次为（1.52±0.56）%、（9.14±0.98）%、（11.09±1.47）%（t=2.206,p=0.07）、（19.89±1.63）%（t=11.29,p<0.001）和（32.30±2.16）%（t=19.527,p<0.001）,其中转染VEGF shRNA2和VEGF shRNA3组与HK组比较差异有统计学意义,说明VEGF shRNA的导入可能部分地抑制了药物对耐药白血病细胞的诱导凋亡作用。MTT结果显示阳性转染组的阿霉素IC50值明显低于HK组和未转染组,各组细胞的IC50值分别为19.23±1.633、18.66±1.632、17.67±1.425（t=0.982,p=0.364）、16.11±1.184（t=2.553,p=0.043）及11.46±1.061（t=7.394,p<0.001）,其中转染VEGF shRNA2和VEGF shRNA3组与HK组比较差异有统计学意义。RT-PCR结果显示:与HK组及未转染组比较,阳性转染组耐药相关基因MDR1、MRP1、topoⅡmRNA的表达水平均出现不同程度的下调,并且均以转染VEGF shRNA3组下调最显著,差异有统计学意义;Western blotting结果显示:阳性转染组MRP1蛋白和topoⅡ蛋白表达水平均低于HK组和未转染组,且均以转染VEGF shRNA3组下调最显著;流式细胞仪显示:5组细胞P-gp的平均荧光强度分别为68.44±2.08、67.59±1.82、61.20±1.47（t=5.463,p=0.002）、58.03±1.63（t=7.823,p<0.001）、40.72±1.22（t=24.51,p<0.001）,阳性转染组P-gp的表达量均明显低于HK组和未转染组,具有统计学差异;说明VEGF可能调节耐药相关基因MDR1、MRP1、topoⅡ的转录及翻译。胞内Rho123潴留试验显示:5组细胞罗丹明123的平均荧光强度分别为11.823±1.611、11.784±1.633、15.683±1.633（t=3.377,p=0.015）、16.158±1.45（t=3.613,p=0.011）、699.294±73.485（t=18.707,p<0.001）（n=4）,各阳性转染组与HK组比较有显著的统计学差异,说明VEGFshRNA的导入可能抑制P-gp及MRP1的外排功能,从而增加细胞内药物的浓度;Western blotting结果显示阳性转染组P-ERK和P-AKT的表达强度明显低于HK组及未转染组,显示VEGF shRNA的导入可以抑制ERK和AKT的磷酸化水平,从而影响其下游基因的转录和翻译。结论:耐药株K562/A02细胞VEGF基因和蛋白的表达水平明显高于其敏感株K562细胞,转染VEGF特异性shRNA能下调K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达,减慢细胞生长,促进细胞凋亡,VEGFshRNA的导入使耐药白血病细胞对阿霉素的敏感性增加,某些耐药相关基因如MDR1、MRP1、topoⅡ表达的下调,可以使PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的活化受抑制。综上,VEGF shRNA可能通过抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的活化来影响耐药白血病细胞的生物学行为,减慢细胞增殖,促进白血病细胞的凋亡,抑制MDR1、MRP1、topoⅡ的表达,增加耐药白血病细胞对药物的敏感性,针对VEGF的基因治疗不仅可以抑制血液系统肿瘤的生长,还可能为逆转肿瘤多药耐药提供一条新途径。