生物除草剂是使用自然界中的微生物、动植物等各类生物及其组织、代谢物进行工业化生产,有效利用、防除特定杂草的生物制剂。利用天然产物开发生物源除草剂已成为未来生物除草剂研发的重要方向之一。灰黄霉素（Griseofulvin）是从灰黄青霉菌（Penicillium griseofulvin）中分离得到的一种含氯的次级代谢产物,在临床医学中应用甚广。在动物细胞中,灰黄霉素能够影响微管的组装和解聚,可能的作用靶点是微管相关蛋白MAPs和y-tublin。然而,关于灰黄霉素在植物方面尤其是与除草活性相关的研究较少。实验室前期研究发现灰黄霉素能够抑制拟南芥根的伸长生长,导致根尖伸长区发生膨大,这和商业除草剂氟乐灵非常类似。氟乐灵是一种根生长抑制类除草剂,通过和植物微管蛋白α和?-tublin结合,干扰细胞分裂,导致根尖分生区发生膨大,进而抑制根伸长生长。进一步研究发现,灰黄霉素能够诱导根细胞活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）大量产生,引起细胞核浓缩,最终导致细胞死亡。但是,灰黄霉素抑制植物根生长的精确作用靶标和机理仍不清楚。本论文通过分析灰黄霉素和氟乐灵处理、微管状态、活性氧产生、细胞死亡、根的生长之间的关系,并结合转录组测序和分析,对灰黄霉素和氟乐灵抑制根生长发育的作用机制进行比较研究,最终揭示灰黄霉素抑制根生长的作用靶点和机理,以期发现新的除草作用靶点,为将来利用灰黄霉素开发新型生物源除草剂提供理论依据。首先,利用组织化学染色法（TBD染色）对灰黄霉素和氟乐灵处理5天后拟南芥根的细胞死亡进行了检测,发现在40μM浓度下,灰黄霉素引起的细胞死亡在过渡区和伸长区发生最为严重,氟乐灵则主要发生在分生区。为了更精确分析灰黄霉素和氟乐灵对根尖各区细胞的影响,利用PI染色法对根尖细胞活力和形态进行了检测。灰黄霉素主要引起伸长区细胞的细胞膜破裂,氟乐灵主要导致分生区细胞膜破裂。FDA染色结果也显示40 μM氟乐灵处理后和前期灰黄霉素的结果相同。ROS清除剂DMTU、DPI、SOD和NAC预处理能够部分恢复细胞活力。DAB和NBT染色结果表明,过渡区是灰黄霉素处理后ROS积累的主要部位,而氟乐灵诱导的ROS主要在分生区产生。这个结果与根细胞死亡和膨大最早发生的部位一致。利用荧光显微镜结合二氯荧光素H2DCF-DA探针检测,发现40 μM灰黄霉素和氟乐灵处理0.5 h后,根中ROS已经开始产生。可见,在灰黄霉素和氟乐灵诱导细胞死亡、抑制根生长过程中,ROS的产生是一个早期事件。然而,这种细胞死亡与微管之间存在何种联系呢?为了探究灰黄霉素和氟乐灵抑制根生长与微管形态结构之间的关系,利用激光共聚焦显微镜结合拟南芥野生型（Col-0）微管绿色荧光标记材料MBD-GFP,对灰黄霉素和氟乐灵处理后根各区的微管形态结构进行监测。40 μM灰黄霉素处理条件下,1h根各区微管形态结构保持完好;3 h根分生区细胞微管正常,过渡区和伸长区部分细胞微管发生解聚,成熟区微管未发生明显变化。可见,灰黄霉素对根微管的影响最早发生在过渡伸长区,这个结果与ROS产生和细胞死亡的结果一致,但微管解聚相对于ROS的产生是较晚的事件。这表明,灰黄霉素通过与最初靶点作用诱导ROS产生,引起微管解聚,导致细胞死亡,最后使根伸长区膨大、并抑制根生长。另一方面,40μM氟乐灵处理条件下,1 h根各区细胞的微管已经发生严重崩解。为了进一步分析氟乐灵对根尖产生影响的最初部位,检测了 20 μM氟乐灵处理后根各区微管和细胞形态变化。低浓度氟乐灵处理10 min,根各区微管未出现明显变化;20 min后,分生区部分细胞的微管出现崩解,其它部分细胞微管正常。可见,氟乐灵处理后根细胞微管破坏非常迅速,低浓度氟乐灵对根微管的影响最初发生在分生区,高浓度氟乐灵会同时对各区细胞微管造成严重破坏。这表明,氟乐灵对微管的影响相对于ROS产生可能是个早期事件或者独立事件。氟乐灵通过和微管蛋白结合破环微管结构诱导ROS产生、或者与其它靶点作用诱导ROS产生,引起细胞死亡,最终导致细胞活力下降和组织膨大,抑制根的生长。然而,为什么根不同区域细胞的微管会对灰黄霉素和氟乐灵处理表现出不同的敏感性?为了解答这个问题,我们对灰黄霉素和氟乐灵处理后根尖细胞微管形态结构发生变化前的材料进行了转录组测序和分析。通过分析40 μM灰黄霉素处理1 h和20 μM氟乐灵处理10 min的拟南芥根的转录组数据,发现在灰黄霉素和氟乐灵处理早期（微管尚未出现伤害）分别有921个和560个基因的表达量发生显著变化。结合Mapman基因功能、GO富集和KEGG通路分析,我们发现灰黄霉素主要影响生长素、乙烯、细胞分裂素和赤霉素相关基因表达。其中与生长素相关的铝诱导蛋白基因Alin（AT4G27450）和SAUR类生长素反应蛋白家族基因（AT2G37030）,以及乙烯合成酶基因ACS6（AT4G11280）和乙烯响应转录因子ETR2（AT3G23150）这4个基因变化最大。对于氟乐灵而言,主要影响生长素相关基因的表达,其中主要影响的是SAUR类生长素反应蛋白家族基因。值得注意的是受灰黄霉素和氟乐灵显著影响的生长素基因完全不同。此外,二者对一些微管相关蛋白基因有明显影响。灰黄霉素显著增加了纤维素合成酶CSLA10（AT1G24070）和微管蛋白-酪氨酸连接酶TTL（AT4G21920）的基因表达水平,明显降低了纤维素合成酶相似蛋白CSLB4（AT2G32540）、细胞周期蛋白CYCU1-1（AT3G21870）和微管蛋白TUBB5（AT1G20010）的基因表达水平,这5个基因与微管的组装和动态稳定性有关。氟乐灵对微管相关蛋白基因TPX2（AT3G01710）、MADA1（AT4G02800）和CDC20-1（AT4G33270）影响显著。这表明,除了文献报道的微管结构蛋白α和?-tublin外,生长素相关蛋白和这3个微管相关蛋白也可能是氟乐灵的最初靶点。灰黄霉素的主要作用位点可能是生长素和乙烯相关基因,以及微管相关的纤维素合成酶CSLA10、微管蛋白-酪氨酸连接酶TTL、纤维素合成酶相似蛋白CSLB4、细胞周期蛋白CYCU1-1和微管蛋白TUBB5基因,而不是微管结构蛋白α和?-tublin。最后,根据以上的结果结合文献研究,我们建立了灰黄霉素和氟乐灵的作用模式图。灰黄霉素通过影响生长素和乙烯相关基因表达量增加根中生长素和乙烯水平,进而激发伸长区细胞ROS含量升高,诱导细胞死亡和组织膨大,抑制根的生长;同时,灰黄霉素能够影响非微管结构蛋白基因的表达,进而影响微管结构和动态稳定性,导致细胞变形解体,抑制根的生长。氟乐灵通过和微管结构蛋白α和?-tublin结合,引起细胞微管解聚、细胞变形解体,抑制根的生长;同时,氟乐灵能抑制生长素相关基因的表达降低根中生长素水平,诱导分生区细胞ROS增加,导致细胞死亡和组织膨大,抑制根的生长。