目的：肿瘤细胞代谢发生根本性改变,与正常细胞相比,肿瘤细胞摄取糖类急剧增加,并且利用糖类方式也发生改变。经大量研究及前期实验发现肝癌(HCC,hepatocellular carcinoma)中糖分解代谢主要依赖糖酵解及磷酸戊糖途径为主,而氧化磷酸化处于“失用”状态。线粒体是执行氧化磷酸化的主要细胞器,为细胞供能,线粒体基因编码合成氧化磷酸化组成蛋白,线粒体功能障碍或基因改变是否导致氧化磷酸化的“失用”目前尚不清楚。细胞中miRNA (microRNA,微小RNA)大量存在并且广泛调控基因转录,抑制靶基因表达水平,那么miRNA是否参与调控磷酸戊糖途径基因,从而影响肝癌磷酸戊糖途径的代谢?snoRNA (small nucleolar RNA,小核仁RNA)作为蛋白合成器核糖体中rRNA的重要调节因素,是否在肝癌中异常表达,从而影响蛋白合成?因此本研究目的在于：1.从基因水平,探索肝癌线粒体基因组突变情况及对氧化磷酸化的影响；2.从转录后水平,探索miR-1 (microRNA-1)对肝癌磷酸戊糖途径通路关键酶TKT(transketolase,转酮醇酶)、G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase,6-磷酸葡萄糖脱氢酶)基因的调控作用及其对磷酸戊糖途径的影响；3.从翻译水平,探索肝癌SNORD78(small nucleolar RNA78,小核仁RNA78)表达水平及对肝癌细胞生物学行为的影响,并初步建立茎环法逆转录SNORD78的方法。方法；1.采用线粒体全基因组扩增、Sanger直接测序筛查及克隆测序验证的方法,筛查肝癌中线粒体基因体细胞突变；采用大片段基因合成法合成野生型及突变型COX3 (cytochrome c oxidase 3,细胞色素c氧化酶3)基因,并亚克隆至pcDNA3.1-Mito载体中,转染至肝癌细胞HepG2中,检测细胞产生ATP、乳酸水平,流式细胞术分析细胞凋亡及ROS水平。2.生物信息学软件预测miR-1调控磷酸戊糖途径关键酶TKT及G6PD,实时荧光定量(real-time PCR, RT-PCR)分析肝癌中miR-1表达水平。在肝癌细胞HepG2中共转染miR-1-3p及靶基因后,双荧光素酶报告实验检测荧光强度,Western blot检测靶基因蛋白水平以验证miR-1-3p调控靶基因TKT及G6PD。肝癌细胞HepG2过表达miR-1后,流式细胞术分析细胞凋亡及ROS水平；CCK-8实验检测细胞活力；显色法检测细胞产生乳酸、NADPH水平。3. RT-PCR分析肝癌组织及肝癌血浆中SNORD78表达水平。siRNA下调肝癌细胞SK-Hep-1中SNORD78表达,采用RT-PCR验证SNORD78及其宿主基因GAS5(growth arrest-specific transcript 5,生长抑制特异性转录物5)表达水平,流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期,CCK-8法检测细胞活力,Transwell实验检测细胞迁移与侵袭。采用茎环法逆转录SNORD78, Taqman探针法检测及digitalPCR验证肝癌血浆中SNORD78表达水平。结果：1.肝癌线粒体基因体细胞突变(1)检测56对肝癌组织及对应白细胞线粒体全基因序列,对比癌组织与白细胞序列,共筛选出51种肝癌线粒体基因体细胞突变,在肝癌中发生率约为(27/56)48.2%；其中非同义突变共有11种,在肝癌中发生率约为(6/56)10.7%,非同义突变在线粒体编码基因均匀分布且突变率较低,未发现突变热点；异质性突变在肝癌组织及白细胞中均可见,发生率分别为21.4%(12/56)、12.5%(7/56)。(2)COX3是人类线粒体基因组高度保守基因,因此挑选该基因G9267A突变作为探索肝癌线粒体基因突变功能的模型。(3)G9267A突变型较野生型合成ATP水平减少、ROS水平增加,且随突变率升高,细胞合成ATP减少、ROS增加(P for trend=0.0152,<0.001); G9267A突变型较野生型产生乳酸水平增多,随突变率升高而增多(P for trend=0.0461).另外,G9267A突变型较野生型发生细胞凋亡现象增多,凋亡率随着突变率升高而降低(P for trend=0.0005)。实验显示G9267A突变损伤肝癌细胞线粒体氧化磷酸化能力、增强糖酵解活性,并且随G9267A突变率升高,氧化磷酸化能力降低、糖酵解能力增强。2.肝癌miR-1表达水平及其对磷酸戊糖途径的影响(1)肝癌组织miR-1-3p水平较癌旁组织降低(P=0.001),且与TNM分期呈负相关(P=0.043)。(2)转染miR-1-3p较阴性对照显著抑制荧光素酶基因的活性(P<0.001),并且显著下调TKT与G6PD的mRNA水平及蛋白水平(P<0.001,<0.001),明确miR-1-3p对G6PD及TKT基因具有靶向调控作用。(3)肝癌细胞HepG2过表达miR-1-3p可促进细胞周期停滞在S期,阻止细胞有丝分裂；抑制HepG2细胞增殖；促进细胞产生ROS及细胞凋亡；抑制细胞合成NAPDH,促进乳酸合成(P均<0.05)。表明miR-1不仅影响肝癌细胞的生长、增殖与凋亡,而且负性调控肝癌细胞磷酸戊糖途径的关键酶TKT、G6PD基因,致磷酸戊糖途径活性增强。3.肝癌SNORD78表达水平及其对肝癌细胞生物学行为的影响(1)肝癌组织中SNORD78表达水平较癌旁组织高(P=0.004),且与肝癌肿瘤个数、分期及远处转移成正比(P=0.02,0.014,0.01)；Kaplan-Meier生存曲线分析显示,高表达SNORD78肝癌患者总体生存期和无瘤生存期显著低于低表达患者(P=0.023,0.014)。暗示SNORD78表达可作为评估肝癌预后的潜在生物学指标。(2)下调肝癌细胞SK-Hep-1中的SNORD78后,两干扰组均与阴性对照组的SNORD78表达显著降低(P均<0.05),GAS5表达无显著差异。下调SNORD78水平显著促进SK-Hep-1细胞凋亡(P均<0.05),使细胞停滞在G0/G1期(P均<0.05),阻滞细胞进入S期(P均<0.05),同时抑制SK-Hep-1细胞增殖(P均<0.05),并抑制细胞迁移与侵袭能力(P均<0.05)。(3)肝癌患者血浆中SNORD78水平较正常对照组降低(P=0.0138),与肝硬化患者无差异(P=0.1281)；且与肝癌肿瘤个数、分期成反比(P=0.016,0.039)。(4)茎环法逆转录与加“A”法、特异法逆转录检测SNORD78的相关性分别是(R2=0.7626,P=0.0015；R2=0.8198,P=0.00103)。采用茎环法逆转录并Taqman探针法检测肝癌血浆中SNORD78表达较正常人降低(P<0.05),digital PCR验证肝癌血浆中SNORD78表达,与Taqman探针法相符。因此,本文改良的茎环法逆转录SNORD78是一种稳定可靠的方法。结论：1.肝癌线粒体基因体细胞COX3-G9267A突变损伤肝癌细胞氧化磷酸化能力,并增强糖酵解能力。2.肝癌中低表达的miR-1通过靶向调控磷酸戊糖途径关键酶G6PD及TKT基因,抑制靶基因转录,导致肝癌中磷酸戊糖途径活性增强。3. SNORD78高表达与肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力相关,可作为评估肝癌预后的潜在生物学指标。并初步建立改良茎环法逆转录SNORD78的方法。