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目的头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)主要影响口腔、舌咽部、口咽部、喉部以及涎腺等各个方面的功能,在口腔的恶性肿瘤类型中处于第六名的位置。而在口腔颌面部中的恶性肿瘤中,口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占了相当大的比例,大约80%左右。虽然近几年我们致力于OSCC的治疗以及相关发病的机制研究,并且取得了一定程度上的进展以及突破,但是在过去的几十年期间,口腔鳞状细胞癌病人的存活率却始终没有太过明显的提升和改善,平均每年确诊病例中死亡率仍可以达到50%甚至以上。舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)当中最为好发,具有较高的远处转移率和增殖能力。TSCC通常会导致言语,咀嚼及吞咽功能障碍。虽然,TSCC的治疗方案已经取得了一定进展,但TSCC的死亡率仍然很高。因此了解参与TSCC发展进程的分子机制,寻找TSCC的治疗靶点,发现TSCC新的治疗策略是有必要的。microRNA(miRNA)是一类非编码、并且拥有较小分子量的RNA,它发挥作用的方式是通过结合其靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR),在转录以后水平调控相关基因的表达。近年有学者通过实验发现,多种类型的miRNA分子通过沉默或者抑制癌基因表达的这种方式,从而参与到癌细胞生物程序的调控之中。已经有研究证实,miR-137在肿瘤发生发展中起重要作用。然而,miR-137在舌鳞状细胞癌中的作用的尚不清楚。为明确miR-137对舌鳞状细胞癌生物学行为的调控作用,并初步探索其分子生物学机制。本研究中,检测了舌鳞状细胞癌组织及细胞中,miR-137的表达的相对水平,并通过这种细胞转染miR-137 mimic或着scramble检测细胞生物学行为的方式来改变。合成miR-137靶基因SP1的3’非编码区(untranslated regions,UTR)并插入海肾荧光素酶报告质粒。细胞用miR-137 mimic或scramble和pGL3-SP1-3’UTR或MUT3’UTR共转染48h,利用双荧光素酶报告系统进行测定。从而探讨MicroRNA-137对舌鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响及对其分子调控.机制的初步研究。方法第一部分:miR-137在舌鳞状细胞癌(TSCC)中的表达及表观遗传学对舌鳞状细胞癌细胞miR-137表达的调控。提取细胞总RNA,随后反转录过程成为cDNA,然后用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)来做内参,使用实时荧光定量PCR对舌鳞状细胞癌(TSCC)组织和其相关对照的正常组织进行一系列相关检测,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系(SCC4,SCC1,UM1和Cal27)、正常口腔角质细胞NOK16B细胞系和正常口腔角质细胞(NHOK)miR-137表达。舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1,UM1采用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)又或者采用组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古霉素A(TSA)处理24 h。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)用来测定细胞处理后miRNA-137的基因表达。第二部分:miR-137通过靶基因SP1对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1生物学行为产生影响。MTT试验、集落形成实验、细胞侵袭实验和细胞划痕实验来探讨miR-137 mimics和scramble转染舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1后对肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1分别转染miR-137 mimics,scramble后E-cadherin,N-catenin,Snail,Vimentin蛋白在舌鳞癌组织中的表达。靶向扫描(TargetScan)探究miR-137潜在的靶增殖基因。对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1用实时荧光定量PCR检测miR-137 mimics组、scramble组转染后SP1的表达。应用生物信息学和分子生物学技术,克隆SP1基因的3’UTR区并连接到荧光素酶报告基因载体PGL3-REPORT上。所构建的新载体命名为pGL3-REPORT-SP1-3’UTR。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-137和SP1基因的靶向关系。结果第一部分:用实时荧光定量PCR分别检测25组舌鳞状细胞癌(TSCC)组织和25组正常对照组,分别测定了 miR-137的表达。相对于正常对照组,TSCC组织中miR-137的表达下调。此外,我们也证明,与正常口腔角质细胞NOK16B细胞系和正常口腔角质细胞(NHOK)相比,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系(SCC4,SCC1,UM1 和 Cal27)中 miR-137 表达下调(P<0.001)。②TSCC细胞系SCC1,UM1用0.5,1.5及3μmol/L 5-Aza-CdR(腔角质细胞甲基化抑制剂,5-氮杂-2’-脱氧胞苷,5-Aza-CdR)亦或是300 nmol/L的TSA(组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古霉素,TrichostatinA,TSA)处理24h。我们发现采用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR),亦或是组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古霉素A(TSA)处理后的舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1,UM1中miR-137表达均上调。第二部分:①SCC1细胞系miR-137的表达量,转染scramble组和miR-137 mimic组分别是0.6327±0.12、32.725±0.34(P<0.001)。②MTT实验中,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1转染miR-137 mimics后,对细胞增殖的抑制能力相较于于对照组来说明显的提升,且此种差异具有统计学方面的意义(P<0.05)。在集落形成实验当中,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1转染miR-137 mimics组细胞集落数要明显的低于转染scramble组,而且此种差异具有统计学的意义(P<0.05),这提示着miR-137的表达可以显著的降低舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞的增殖能力。③转染miR-137 mimics组较转染scramble组,上皮细胞生物学标志E-钙粘蛋白的表达升高,间充质细胞生物学标志N-钙粘蛋白、波性蛋白及Snail的表达降低。这些结果提示,miR-137抑制SCC1细胞的上皮间充质转化,且此种差异具有统计学的意义(P<0.05)。④我们通过细胞体外侵袭实验得出结论:舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1转染miR-137 mimics组细胞数明显低于转染scramble组,且此种差异具有统计学的意义(P<0.05),提示miR-137过表达能显著降低舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞的侵袭能力。细胞划痕试验中,转染miR-137 mimics组细胞的划痕愈合速度较慢。提示miR-137过表达能有效的抑制细胞迁移能力,且此种差异具有统计学方面的意义(P<0.05)。⑤在实时荧光定量PCR的实验检测当中我们可以看出,在SCC1 细胞中,pGL3-REPORT-SP1-3’UTR 与 scramble 共转染组、pGL3-REPORT-SP1-3’UTR 与 miR-137 mimics 共转染组、pGL3-REPORT-MUT 3’UTR 与 miR-137 mimics 共转染组、pGL3-REPORT-MUT 3’UTR 与 scramble共转染组的荧光素酶相对表达量分别为0.97±0.07、0.47±0.06、0.97±0.08、0.98±0.09,说明miR-137抑制了野生型SP13’UTR载体的荧光素酶活性,差异有统计学意义(P<0.05)。在Western-blot检测当中,SCC1细胞,转染miR-137 mimics组与转染scramble组相比较,SP1蛋白的表达量明显的降低。MTT实验中,SP1与miR-137 mimics共转染组较control与scramble共转染组细胞增殖能力明显增高,且此种差异具有统计学方面的意义(P<0.05)。在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的相关检测当中,在SCC1细胞中,SP1与miR-137mimics共转染组较control与scramble共转染组,上皮细胞生物学标志E-钙粘蛋白的表达降低,间充质细胞生物学标志N-钙粘蛋白、波性蛋白及Snail的表达升高。这些结果提示,miR-137通过SP1调控SCC1细胞的上皮间充质转化,且此种差异具有统计学的意义(P<0.05)。结论1、相对于正常对照组织,舌鳞状细胞癌(TSCC)组织中miR-137的表达下调。与正常口腔角质细胞NOK16B细胞系和正常口腔角质细胞(NHOK)相比,在舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系(SCC4,SCC1,UM1和Cal27)中miR-137表达均下调。2、在舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞中,miR-137表达受表观遗传学调控。3、MiR-137抑制舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞的增殖能力、集落形成能力、上皮间充质转化、侵袭和迁移能力。4、在舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞中,MiR-137靶向于SP1,并通过SP1调控SCC1的增殖能力与上皮间充质转化。